聚左旋乳酸通过其代谢产物乳酸减少真皮脂肪组织体积

聚左旋乳酸通过其代谢产物乳酸减少真皮脂肪组织体积

金雯 ⁴, 陈刚 ⁵, 陈威 ¹, 乔冠群¹, 邓乐曲 ¹, 李锴 ^2,3, ✉, 蔡薇^1, ✉

¹南京医科大学第二附属医院整形外科，中国南京 210003

²南京医科大学附属泰州人民医院内分泌科 / 南京医科大学泰州临床医学院，中国泰州 225300

³江苏省人类功能基因组学重点实验室（南京医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系），中国南京 211166

⁴南京医科大学附属逸夫医院病理科，中国南京 211100

⁵南京医科大学第一附属医院病理科，中国南京 210029

摘要

聚左旋乳酸（Poly-L-lactic acid, PLLA）是一种成熟的生物刺激剂，可通过诱导胶原酶生成广泛应用于临床皮肤抗衰老治疗。然而，PLLA对成纤维细胞之外其他真皮细胞亚群的精确调控机制尚未完全阐明。本研究通过构建体内PLLA注射模型和体外PLLA-脂肪细胞共培养模型，系统分析了PLLA对真皮脂肪细胞体积、分化、脂解及产热能力的调控作用。研究发现，PLLA注射可显著减少小鼠真皮脂肪层厚度。共培养实验显示，PLLA虽不影响脂肪生成，但能显著促进脂解活性。值得注意的是，PLLA还能增强脂肪细胞向具有更高产热能力的米色脂肪细胞分化。在机制研究中，我们采用单羧酸转运蛋白（MCT1/4）抑制剂阻断脂肪细胞对乳酸的摄取，证实PLLA对真皮脂肪细胞的调控作用依赖于其代谢产物乳酸。综上，本研究揭示PLLA对真皮细胞具有复杂调控作用，其改善皮肤衰老的机制不仅源于刺激胶原合成，还部分涉及对脂肪细胞的调控。

关键词：聚左旋乳酸，真皮脂肪，脂解作用

介绍

皮肤作为人体最大的器官，由表皮和真皮构成，不仅提供抵御外界伤害的物理屏障，还在体温调节中发挥关键作用。然而，由于持续且不可逆的皮肤衰老进程——这一过程表现为皱纹、色素沉着、毛细血管扩张等多种表型[1-3]，皮肤的保护功能逐渐减弱，并影响面部与体态外观。皮肤衰老不仅损害人体生理功能，还会引发心理压力与社会焦虑[4]。因此，有必要为衰老皮肤提供合理治疗，以避免强化社会负面审美观念，同时保持理性的治疗预期。

皮肤衰老是内外因素共同作用的连续性过程，其特征是真皮层胶原蛋白合成与含量下降[5]。真皮成纤维细胞分泌的胶原蛋白构成丰富的细胞外基质（ECM），其中驻留脂肪细胞等多种细胞类型[6]，并为表皮提供结构支撑。最新研究发现，除胶原减少外，皮肤衰老的另一重要特征是真皮白色脂肪组织（dWAT）的增生。动物模型研究表明，31周龄[7,8]或12月龄[9]老年小鼠的dWAT含量显著增加。此外，紫外线辐射（皮肤衰老最重要的外源性因素）也会导致dWAT增生[10]。近期数据揭示dWAT来源的脂质可通过旁分泌作用影响真皮成纤维细胞代谢[11]，因此真皮脂肪细胞现已成为抗皮肤衰老策略的关键靶点[12]。

在临床治疗皮肤衰老性松弛与塌陷时，注射用真皮填充剂已成为重要工具。其中聚左旋乳酸（PLLA）作为一种生物相容性、可降解吸收的聚合物，因其长期良好的美容效果已在全球广泛应用[13]。这种具有L-旋光结构的α-羟基酸聚合物在医疗领域已有超过30年的安全使用历史[14,15]。携带溶液注入皮肤的PLLA填充剂能即刻增加注射部位容积，但随着溶液被组织吸收，该效果迅速消失[16]。残留的PLLA颗粒降解为乳酸，通过促进胶原合成逐渐增加真皮厚度[17,18]。然而，PLLA对dWAT形态及生物学功能的影响尚不明确。

本研究通过体内外实验分析PLLA对dWAT的调控作用，并利用单羧酸转运蛋白（MCT1/4）抑制剂阻断脂肪细胞对乳酸的摄取，以阐明PLLA的上述作用是否依赖其分解产物乳酸。

材料和方法

材料

聚左旋乳酸（PLLA）购自长春圣博玛生物材料有限公司（商品名：Löviselle® PLLA面部填充剂，注册证号：国械注准20213130276，规格：340 mg/瓶）。MCT1/4抑制剂7ACC1购自MedChemExpress（货号：#HY-D0067）。

乳酸浓度检测

培养基或脂肪细胞中的乳酸浓度采用比色法乳酸检测试剂盒（货号：#ab65331，Abcam）测定。简要步骤如下：含乳酸样本经乳酸脱氢酶处理后发生氧化反应，其产物与探针作用生成显色物质（最大吸收波长λmax=450 nm），具体操作参照试剂盒说明书。对于细胞内乳酸含量检测，收集2×10⁶个细胞并用预冷PBS洗涤后，按细胞沉淀体积加入4倍裂解液（试剂盒提供）。10,000×g离心3分钟后取上清检测乳酸含量，最终数据以总蛋白浓度进行标准化校正。

细胞活性检测

将真皮成纤维细胞接种于48孔Trans-well板中，培养至接触抑制状态后诱导分化为脂肪细胞。分化起始时，在Trans-well上层加入PLLA（200μg/mL培养基）与脂肪细胞共培养至指定时间。细胞活性通过CCK8试剂盒（货号：#CA1210-100T，索莱宝）进行评估。

真皮成纤维细胞分离

实验采用3-4日龄野生型C57BL/6j小鼠背部皮肤组织。皮肤样本经75%乙醇冲洗后剪切成小块，使用预先配置的I型胶原酶溶液（2 mg/ml，货号#SCR103，Sigma）进行消化，该消化液以DMEM基础培养基（货号#C11995500BT，Gibco）配制，含2%胎牛血清（Gibco）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，经0.22 μm滤膜除菌后避光保存。保持胶原酶与组织体积比为3:1，37℃水浴消化1小时，期间每5分钟颠倒混匀一次。消化后的细胞悬液经70 μm滤网过滤，100×g离心10分钟，PBS重悬后再次同条件离心。采用含15%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F-12培养基（货号#MA0214，美仑生物）培养原代真皮成纤维细胞，接种至合适规格的多孔板中。24小时后首次换液，之后每48小时更换培养基直至细胞生长至接触抑制状态。

脂肪细胞分化与PLLA共培养实验

当细胞完全覆盖培养板后开始分化。对于米色脂肪形成，培养基中添加胰岛素(0.5μg/ml，#I3536，Sigma)、地塞米松(5μM，#D4902，Sigma)、三碘甲状腺原氨酸(T3，1nM，#T2977，Sigma)、罗格列酮(1μM，#R2408，Sigma)和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.5mM，#I5879，Sigma)。48小时后更换为仅含胰岛素、T3和罗格列酮的培养基，之后每48小时更换一次。7-8天可观察到脂滴形成，表明成功诱导了米色脂肪形成。

对于白色脂肪形成，在相同诱导培养基中加入胰岛素(1μg/ml)、地塞米松(1μM)和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.5mM)。48小时后更换为仅含胰岛素的培养基以维持脂肪细胞分化。

使用trans-well进行PLLA与脂肪细胞的共培养。在诱导间充质干细胞分化为成熟脂肪细胞的同时，将其与PLLA(200μg/mL培养基)或空白对照培养室共同培养，直至分化完成或达到各实验指定的时间点。

细胞在37℃、含5% CO2的适宜气氛中培养。

细胞油红O染色

油红O染色前，细胞用4%多聚甲醛固定15分钟。将饱和油红O染料与ddH₂O按3:2比例混合，经0.45μm滤膜过滤后使用。细胞染色15分钟后，用PBS清洗3次。所有细胞均使用奥林巴斯显微镜拍照。

通过100%异丙醇萃取油红O染色，在510nm波长下使用分光光度计(Evolution One；Thermo-Fisher Scientific)测定吸光度，对染色进行定量分析。

甘油三酯含量测定

脂肪细胞用PBS冲洗两次。向培养皿中加入细胞裂解液(1 M Tris-HCl、1 M MgCl2、10% Triton X100)，通过冻融循环充分裂解细胞。按照说明书使用甘油三酯检测试剂盒(#632-50991，LabAssayTM Wako)测定甘油三酯含量。各样品甘油三酯含量均按其相应蛋白含量进行标准化。

甘油和非酯化脂肪酸释放实验

按前述方法分离原代真皮成纤维细胞并诱导分化为白色脂肪细胞7天。成熟脂肪细胞与200μg/mL PLLA共培养24小时后，用Krebs-Ringer-HEPES(KRH)缓冲液(121 mM NaCl、4.9 mM KCl、1.2 mM MgSO₄、0.33mM CaCl₂、12 mM HEPES，pH7.4)冲洗两次，随后在37℃下用含3%无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)和1μM异丙肾上腺素的KRH缓冲液孵育指定时间。分别使用游离甘油检测试剂盒(#E1012，Applygen)和非酯化脂肪酸(NEFA)试剂盒(#633-52001，LabAssayTM Wako)测定培养基中释放的甘油和NEFA含量。

动物模型

选用8周龄雄性C57BL/6j小鼠，经异氟烷麻醉后剃毛。注射器由腹中线刺入，沿皮下小心移动至腹部外侧位置，注射PLLA并确保填充物无渗漏。对照组小鼠注射等量生理盐水。继续常规饲养2个月后，取注射部位皮肤进行后续分析，同时分离小鼠腹股沟皮下脂肪组织(sWAT)和附睾脂肪组织(eWAT)。

组织学分析

注射部位皮肤组织经4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋后制备5μm厚度切片，复水后进行苏木精-伊红(H&E)染色。所有切片均采用奥林巴斯显微镜拍摄。使用ImageJ软件测量脂肪细胞直径，每组随机选取3只小鼠，每只小鼠获取6-8个dWAT切片进行统计分析。

蛋白质提取与免疫印迹分析

新鲜细胞样本经预冷裂解缓冲液（含50 mmol/L Tris-HCl pH7.4、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L苯甲基磺酰氟及蛋白酶抑制剂复合片剂1片/10 mL；Roche公司）裂解后获取蛋白样品。采用BCA蛋白定量试剂盒（Takara，T9300A）测定蛋白浓度，等量调整后沸水浴处理10分钟。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，转印至甲醇预活化的PVDF膜（Millipore Corp，美国），5%脱脂牛奶封闭后依次孵育一抗和二抗。使用高灵敏度ECL显色液（Tanon，180-5001）检测蛋白条带。

RNA提取与定量PCR

采用Trizol试剂（Invitrogen）提取细胞总RNA，1 μg RNA通过HiScript II Q RT SuperMix反转录试剂盒（Vazyme，R222-01）合成cDNA。与ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，Q321-02）按比例混合后，使用Light Cycler 480 II荧光定量PCR系统（Roche，瑞士巴塞尔）进行扩增反应。所用引物序列信息详见表1。

表1. 引物

统计学分析

本研究数据均以均值±标准误（mean ± SEM）表示。组间比较采用双尾Student t检验（两组比较）或单因素方差分析（多组比较）。所有统计分析均通过GraphPad Prism 8软件（GraphPad Software公司）完成。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

PLLA减小C57小鼠dWAT细胞体积

为探究PLLA对脂肪组织的潜在调控作用，我们建立了小鼠PLLA注射模型。皮下注射PLLA后（图1A），小鼠继续常规饲养两个月。结果显示，PLLA注射既未影响小鼠总体重（图1B），也未改变腹股沟白色脂肪组织（iWAT）或附睾脂肪组织（eWAT）的重量（图1C）。

图1. PLLA处理减小C57小鼠真皮白色脂肪组织(dWAT)细胞体积。A. PLLA注射模型示意图。小鼠麻醉后，按材料与方法部分所述操作进行皮下PLLA注射。B. PLLA注射两个月后小鼠体重变化。C. PLLA注射两个月后小鼠腹股沟脂肪组织(iWAT)与附睾脂肪组织(eWAT)重量。D. 真皮组织形态学染色结果。上图：胶原纤维Masson染色；下图：显示整体形态的H&E染色。两条虚线间区域标示dWAT位置。E. dWAT中不同直径脂肪细胞的百分比分布。数据以均值±标准误表示。* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001

然而，dWAT的组织学染色显示出显著变化。Masson染色表明，PLLA处理可维持真皮层内胶原蛋白含量（图1D），这与其已知的胶原刺激生物功能一致[19]。与胶原增加形成对比的是，H&E染色显示PLLA处理组小鼠的dWAT厚度显著减小（图1D）；脂肪细胞大小的统计学分析发现，PLLA组中大体积细胞比例显著降低，而小脂肪细胞比例相应增加（图1E）。此外，小鼠非注射部位的dWAT厚度与对照组相当，表明dWAT的减少仅发生在注射部位。

PLLA在体外实验中未表现显著细胞毒性

为探究PLLA（图2A）减小真皮脂肪细胞体积的具体机制，我们构建了PLLA与真皮成纤维细胞来源脂肪细胞的共培养模型（图2B）。鉴于PLLA的已知生物效应主要依赖其降解产物——乳酸，我们首先检测了共培养体系中的乳酸水平。结果显示，PLLA共培养能快速提升培养基中乳酸浓度，并可稳定维持至少四天（图2C）。

图2. PLLA对成纤维细胞和脂肪细胞无明显细胞毒性。A. PLLA的结构式。B. 使用trans-well板的共培养系统示意图。C-D. 分别测定培养基(C)和脂肪细胞(D)中的乳酸水平。将原代真皮成纤维细胞诱导分化为白色脂肪细胞。分化4天后，脂肪细胞与PLLA共培养指定时间。实验开始时同时加入Mct1/4抑制剂7ACC1。每组n=3。E. 测定PLLA处理后不同时间点的脂肪细胞活性。分离原代真皮成纤维细胞并分化为白色脂肪细胞。分化开始时，细胞与PLLA共培养指定时间。每组n=6。数据以均值±SEM表示。+PLLA-7ACC1组与-PLLA-7ACC1组比较：* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。+PLLA+7ACC1组与+PLLA-7ACC1组比较：##: p<0.01；###: p<0.001

阐明PLLA-乳酸对脂肪细胞的作用机制源于胞外还是胞内，我们使用Mct1/4（乳酸转运蛋白）抑制剂7ACC1处理细胞。结果显示，7ACC1能显著降低脂肪细胞内乳酸水平，但对培养基中乳酸浓度无影响（图2C、D）。CCK8实验表明PLLA处理未显著抑制脂肪细胞活性（图2E），证实其减小脂肪细胞体积的效应不依赖于毒性作用。

PLLA在体外对脂肪细胞分化和脂质积累无显著影响

我们进一步探究了PLLA对脂肪生成的体外作用。通过油红O染色显示的脂滴数量（图3A、B）以及脂肪细胞内总甘油三酯含量（图3C）表明，无论是单独使用PLLA还是PLLA联合Mct1/4抑制剂处理，均未显著改变脂肪细胞的分化能力。三组间脂肪细胞标志基因（Pparγ[图3D]、C/ebpα[图3E]和Fasn[图3F]）的表达水平相当，提示PLLA处理不影响脂肪生成过程。

图3. PLLA在体外对脂肪细胞分化和脂质积累无影响。原代真皮成纤维细胞被诱导分化为白色脂肪细胞，分化开始时即设置PLLA共培养组与对照组，每组n=3。A. 第8天脂滴油红O染色结果。B. 油红O染色定量分析。C. 第8天脂肪细胞内甘油三酯(TG)含量测定。D-F. 第8天白色脂肪标志基因mRNA水平的定量PCR分析：Pparγ(D)、C/ebpα(E)和Fasn(F)。数据以均值±标准误表示。

PLLA在体外增强真皮脂肪细胞脂解作用

我们进一步分析了PLLA对脂解的潜在影响。在去甲肾上腺素刺激的脂解状态下，PLLA共培养的脂肪细胞表现出更强的脂肪动员能力，表现为向培养基中释放更多的脂解产物（包括甘油[图4A]和脂肪酸[图4B]）。蛋白质（图4C）和mRNA（图4D-F）水平检测表明，PLLA显著提高了关键脂解酶（如磷酸化激素敏感脂肪酶[p-HSL，由Lipe基因编码]、脂肪甘油三酯脂肪酶[ATGL，由Pnpla2基因编码]和AbdH5）的表达，提示这些脂肪细胞具有更强的脂肪分解潜能。值得注意的是，当阻断Mct1/4介导的乳酸摄取时，PLLA对脂解的促进作用几乎完全消失（图4A-F）。上述数据表明，PLLA可显著促进脂肪细胞的脂解作用，且该效应主要依赖于其代谢产物乳酸在细胞内的作用，而Gpr81受体在此过程中几乎不起作用。

图4. PLLA在体外增强真皮脂肪细胞脂解作用。原代真皮成纤维细胞被诱导分化为白色脂肪细胞。完全分化的真皮脂肪细胞（分化后第6天）与PLLA共培养/不共培养24小时，每组n=3。A-B. 在异丙肾上腺素刺激下，等量真皮脂肪细胞（1×10⁵个）于不同时间点释放的甘油(A)和非酯化脂肪酸(B)含量测定。C. 通过免疫印迹检测脂解酶HSL和ATGL的蛋白水平。D-F. 定量PCR分析关键脂解酶基因Pnpla2(D)、Lipe(E)和Adhb5(F)的mRNA水平。数据以均值±SEM表示。+PLLA−7ACC1组与−PLLA−7ACC1组比较：* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。+PLLA+7ACC1组与+PLLA−7ACC1组比较：#: p<0.05；##: p<0.01；###: p<0.001

PLLA在体外促进米色脂肪生成

由于其空间分布特性，皮下白色脂肪组织（dWAT）能够有效接受外界温度刺激并分化为产热的米色脂肪。PLLA处理显著增强了米色脂肪细胞的分化过程，这通过脂滴数量的增加（图5A、B）以及脂肪细胞中总甘油三酯含量的上升（图5C）得以体现。在米色脂肪细胞分化过程中，PLLA刺激的细胞表现出更高水平的米色脂肪标志基因表达（图5D–F），这一点与脂解实验的结果一致。阻断Mct1/4介导的乳酸转运可完全逆转PLLA对米色脂肪生成的促进作用。上述结果表明，PLLA可通过其代谢产物乳酸激活dWAT的米色脂肪生成，而这一过程依赖于Mct1/4。

图5. PLLA在体外增强米色脂肪生成。原代真皮成纤维细胞被诱导分化为米色脂肪细胞。在分化开始时，细胞分别与PLLA共培养或不共培养。两组样本量均为N=3。A. 第8天油红O染色显示的脂滴。B. 油红O染色的定量测量结果。C. 第8天测量的脂肪细胞内甘油三酯(TG)含量。D-F. 第8天定量PCR分析白色脂肪标志基因Cidea(D)、Pgc1α(E)和Ucp1(F)的mRNA水平。数值以均值+SEM表示。+PLLA-7ACC1与-PLLA-7ACC1比较：* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。+PLLA+7ACC1与+PLLA-7ACC1比较：##: p<0.01；###: p<0.001

讨论

随着人口老龄化加剧及对外貌关注度提升，寻求非手术面部与身体年轻化治疗的患者持续增加。女性占美容治疗总数的92%，其诉求主要为维持年轻外貌与吸引力[19]；男性则注重保持阳刚特质[20]。在众多治疗手段中，多种微创技术已被开发并快速应用于美容领域。聚左旋乳酸（PLLA）作为成熟的填充剂和胶原诱导型生物刺激剂，被广泛应用于皮肤抗衰老临床实践——欧洲于1999年、美国FDA于2004年先后批准其美容适应症。PLLA凭借生物刺激作用引发的胶原效应可实现长期美容效果，因而在全球获得广泛应用。然而，PLLA对成纤维细胞以外真皮细胞亚群的精确调控机制尚未完全阐明。本研究通过构建体内PLLA注射模型与体外脂肪细胞共培养体系，系统分析了PLLA对皮肤主要细胞组分——真皮脂肪细胞在体积、分化、脂解及产热能力方面的调控作用。结果表明PLLA可通过其代谢产物乳酸激活真皮白色脂肪组织（dWAT）的脂解与产热功能，提示其临床应用不应仅被视为胶原刺激剂，对真皮脂肪细胞的调控作用可能拓展其临床应用场景。

皮肤是人体分布最广的组织。随年龄增长，皮肤会出现以胶原流失导致的厚度减少为特征的衰老改变。有趣的是，近期动物模型研究发现真皮脂肪细胞在皮肤衰老过程中反而增加[8]，因此这类特殊脂肪细胞已成为抗皮肤衰老策略的重要靶点[12]。本研究针对临床最常用的皮肤填充剂PLLA，通过体内外实验揭示其对真皮脂肪细胞生理功能的调控规律：除经典的促胶原作用外，PLLA可激活真皮脂肪细胞的脂解与产热功能，但对脂肪分化无显著影响。

衰老过程中，皮肤及邻近脂肪组织呈现三种形态学改变：真皮层适度变薄、真皮-皮下组织交界处dWAT显著扩张、皮下白色脂肪组织（sWAT）明显减少[12,21-23]。值得注意的是，dWAT与sWAT在时序性衰老中呈现相反的变化规律，提示dWAT是具有独特功能的细胞群体[8,12]。本研究发现小鼠皮下注射PLLA可显著减少dWAT体积，表现为脂肪层厚度减小与脂肪细胞尺寸缩小。由于脂肪细胞尺寸取决于其脂滴大小，脂解作用通过减少脂滴可缩小细胞体积，而脂肪生成作用则相反。我们认为PLLA减小dWAT体积的效应主要通过激活脂解实现，对脂肪生成无显著影响。但PLLA对sWAT无此效应，其差异调控机制有待进一步解析。

真皮成纤维细胞与脂肪细胞共同构成真皮主要细胞组分，二者可通过代谢物等信号分子进行细胞间通讯。动物模型研究证实，清除真皮脂肪细胞会导致成纤维细胞中游离脂肪酸（FFA）氧化相关基因显著下调[11]，说明真皮脂肪细胞能为邻近成纤维细胞提供FFA代谢底物。本研究中PLLA处理后的真皮脂肪细胞脂解率升高，在减小脂肪体积的同时，也可能通过促进FFA分泌间接调控成纤维细胞功能。这提示PLLA除直接作用于成纤维细胞外，可能还存在依赖脂肪-成纤维细胞通讯的间接调控途径，该假说有待后续研究验证。

作为PLLA主要代谢产物，乳酸可通过两种途径影响脂肪细胞功能：一是作为配体激活膜受体Gpr81[26]，二是经MCT1/4转运入细胞发挥核心代谢物作用[27]。本研究采用Mct1/4抑制剂阻断乳酸内流后，PLLA效应被完全逆转，说明其作用主要依赖乳酸的细胞内效应。但考虑到脂肪细胞高表达GPR81，且乳酸可通过GPR81激活脂肪细胞产热与米色化[28]——这与PLLA的调控效应高度一致，我们尚不能完全排除GPR81的潜在参与。未来构建脂肪细胞特异性GPR81敲除小鼠将有助于阐明该通路是否介导PLLA对真皮脂肪细胞功能的调控。

综上，本研究揭示PLLA具有缩小真皮脂肪细胞体积、增强脂解、促进米色脂肪生成等调控作用。在评估PLLA改善皮肤衰老效果时，不应忽视其对脂肪细胞的潜在影响。

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