由H4K12乳酰化和HDAC3驱动的反馈环在巨噬细胞中通过TGF-β信号通路调控乳酸诱导的成纤维细胞胶原合成

由H4K12乳酰化和HDAC3驱动的反馈环在巨噬细胞中通过TGF-β信号通路调控乳酸诱导的成纤维细胞胶原合成

邹颖^1,2，曹米布²，太美灵 ³，周浩贤⁴，陶丽¹，伍姝¹， 杨凯业³，张有良²，葛远龙^1,✉，王昊^5,✉，罗盛康^1,2,✉，鞠振宇^1,2,✉

¹暨南大学生命科学技术学院衰老与再生医学研究所，再生医学教育部重点实验室，中国广州 510632

²暨南大学附属广东省第二人民医院整形美容科，中国广州 510403

³无限极（中国）有限公司研发中心，中国广州 510640

⁴广东省人民医院广东省心血管病研究所心内科，广东省医学科学院，中国广州 510080

⁵暨南大学附属第一医院麻醉科，中国广州 510632

电子邮箱：geyuanlong@jnu.edu.cn; haowang@jnu.edu.cn; luoshk@gd2h.org.cn; zhenyuju2016@jnu.edu.cn

摘要

成纤维细胞胶原减少是皮肤老化的主要原因之一。乳酸可以通过调控基因转录，通过赖氨酸乳酰化参与胶原合成。然而，乳酸影响胶原合成的具体机制尚需进一步研究。本研究表明，消耗巨噬细胞可以减弱乳酸对成纤维细胞胶原合成的促进作用。通过联合CUT&Tag和RNA测序分析，发现了巨噬细胞中H4K12乳酰化（H4K12la）与组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）之间的反馈环，这一机制驱动了乳酸诱导的胶原合成。巨噬细胞可以通过单羧酸转运蛋白1（MCT1）摄取细胞外乳酸，在聚左旋乳酸（PLLA）刺激下（PLLA是低浓度且持续释放乳酸的来源），通过KAT5-KAT8依赖的机制上调H4K12la水平，从而促进成纤维细胞中的胶原合成。此外，H4K12la在TGF-β1和TGF-β3启动子区域富集，增强了它们的转录。H4K12la的高乳酰化水平抑制了去除酶去除的表达，而HDAC3的激活则减少了巨噬细胞中的H4K12la并抑制了成纤维细胞中的胶原合成。总之，本研究说明巨噬细胞在乳酸诱导的皮肤胶原合成中发挥了关键作用，靶向乳酸-H4K12la-HDAC3-TGF-β轴可能成为增强胶原合成以对抗皮肤老化的一种新方法。

关键词：胶原合成，成纤维细胞，H4K12乳酰化，乳酸，巨噬细胞

1. 介绍

皮肤老化是一个复杂的生理过程，其主要特征是成纤维细胞胶原的减少，这也是皮肤松弛和皱纹形成的重要原因之一。[1] 随着年龄增长，成纤维细胞胶原的合成减少，而其降解增加，导致胶原总量的净减少，从而引发皮肤老化。[2] 皮肤老化可以分为内源性老化和外源性老化两种类型。内源性老化主要受遗传因素影响，自然随时间发生；而外源性老化则由紫外线辐射和污染等环境因素驱动。[3] 同时，抗氧化系统功能受损，活性氧（ROS）水平升高，进一步加剧了胶原的损伤。[4]

乳酸是糖酵解的重要产物，尤其是在细胞缺氧或能量需求增加的情况下。在这些条件下，葡萄糖通过糖酵解途径转化为丙酮酸，随后在乳酸脱氢酶的作用下还原为乳酸。[5] 乳酸不仅在缺氧条件下为细胞提供能量，还可以通过乳酸转运蛋白（MCTs）在细胞间传递，以维持能量平衡并支持免疫反应。[6] 此外，近年来的研究发现乳酸是一种多功能信号分子，可调控免疫反应、[7] 血管生成、[8] 和组织再生。[9] Zhang等首次发现乳酸作为信号分子，通过一种新的蛋白质转录后修饰（PTM）形式——“乳酰化”——来调控基因转录。[10] Zhang等报道，在巨噬细胞中调控乳酸的产生会以剂量依赖的方式影响组蛋白乳酰化（Kla）水平。[10] 此外，最近的研究揭示乳酸可以在免疫反应和组织再生过程中促进非组蛋白乳酰化。例如，Yang等发现脓毒症会导致血清乳酸水平升高，进而促进HMGB1乳酰化，增加内皮细胞通透性。[11] 这些研究表明，乳酸可能通过乳酰化影响基因转录，并直接或间接参与多种病理和生理过程。

近年来，乳酸作为刺激内源性胶原合成的因素引起了越来越多的关注。[12] 我们最近的研究报道，聚左旋乳酸（PLLA）作为低浓度缓释乳酸的来源，通过诱导赖氨酸752位点的非组蛋白LTBP1乳酰化，促进了成纤维细胞中的胶原合成。这一发现为乳酰化修饰在皮肤再生中的作用提供了重要见解。[13] 然而，高浓度乳酸对皮肤胶原的合成有害。机体内乳酸水平升高，特别是在炎症和疾病环境下，会加剧细胞炎症反应，这种效应在肿瘤微环境和免疫介导的炎症性疾病中尤为显著。[14, 15, 16] 因此，我们选择使用聚左旋乳酸（PLLA）将低浓度乳酸长时间释放到皮肤中，而不是直接施用乳酸，这一方法已在我们先前的研究中得到验证。[13]

将PLLA注射到皮肤后，乳酸逐渐释放，招募巨噬细胞。巨噬细胞和成纤维细胞共同参与乳酸刺激的胶原合成。作为关键的免疫细胞，巨噬细胞在组织再生中发挥重要作用；它们主要负责清除细菌、病毒和其他有害物质，同时调节炎症、促进伤口愈合并清除病原体。[17] 在皮肤损伤或感染后，巨噬细胞迁移至患处，清除细菌和病原体，并释放炎症介质以调控炎症反应。[18] 此外，巨噬细胞分泌生长因子和细胞因子，增强皮肤成纤维细胞的增殖和迁移。它们还参与胶原合成和降解的调控，从而促进皮肤再生。[19] 尽管我们最近的研究表明乳酸通过非组蛋白乳酰化促进胶原合成，[13] 巨噬细胞在这一过程中的具体作用仍需进一步研究。

本研究旨在探讨巨噬细胞在乳酸诱导的胶原合成中的作用。在本研究中，我们发现通过氯膦酸脂质体（clodronate-liposomes）耗竭巨噬细胞可减弱乳酸诱导的成纤维细胞胶原合成，表明巨噬细胞在抗击皮肤老化中不可或缺的作用。在机制上，乳酸通过MCT1进入巨噬细胞，乳酰化“修饰酶”KAT5和KAT8协同促进乳酸刺激的巨噬细胞中组蛋白H4赖氨酸12位点（H4K12la）的乳酰化。此外，CUT&Tag分析显示，H4K12la增强了TGF-β1和TGF-β3的转录，这些基因与成纤维细胞胶原合成密切相关。此外，我们发现巨噬细胞中H4K12la与乳酰化“橡皮擦”HDAC3之间存在反馈环，调控皮肤中的胶原合成。综上所述，我们的数据建立了乳酸来源的乳酰化中巨噬细胞-成纤维细胞串话的联系，并揭示了H4K12la和HDAC3之间在皮肤胶原合成中的反馈环，突出了这一轴作为抗皮肤老化干预的潜在靶点。

2. 结果

2.1. PLLA 对巨噬细胞是安全的，并促进其迁移和吞噬功能

对PLLA（聚左旋乳酸）在巨噬细胞中的安全性，特别是RAW264.7细胞和原代骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的安全性进行了评估。在处理不同浓度的PLLA（0、0.25、0.5和1 mg/mL）72小时后，通过CCK-8检测和Calcein-AM/PI染色分别评估了细胞活性和存活率。CCK-8检测显示，在RAW264.7细胞（图S1a,b，补充信息）和BMDMs（图1a,b）中，PLLA处理后细胞活性均未发生变化。在活细胞标记实验中，以α-微管蛋白作为模型蛋白，并使用微管追踪试剂对对照组BMDMs和PLLA处理组BMDMs进行标记（图1c）。MTT检测结果显示，BMDMs中PLLA处理后的细胞活性未发生变化（图1d）。Calcein-AM/PI染色显示，在RAW264.7细胞（图S1c,d，补充信息）和BMDMs（图1e,f）中，PLLA处理后死细胞的数量未显著增加。这些数据表明，作为乳酸来源的低浓度PLLA对巨噬细胞是安全的。随后，研究了PLLA对巨噬细胞迁移和吞噬功能的影响。划痕实验表明，在PLLA处理后12小时和24小时，浓度为0.25和0.5 mg/mL的PLLA显著促进了BMDMs的迁移（图1g,h）。接下来，我们评估了乳酸是否影响巨噬细胞的吞噬功能。在对照组和PLLA处理组BMDMs中加入荧光微球4小时后，F4/80（巨噬细胞标志物）的免疫荧光染色结果显示，PLLA处理组BMDMs中每个细胞吞噬的微球数量显著高于对照组，并呈剂量依赖性（图1i,j）。这些结果表明，PLLA释放的乳酸以剂量依赖的方式增强了巨噬细胞的迁移和吞噬能力。

图1. PLLA 对巨噬细胞是安全的，并促进其迁移和吞噬功能。a) BMDMs处理不同浓度（0、0.25、0.5和1 mg mL−1）的PLLA 72小时后，使用相差显微镜观察细胞形态。b) 使用细胞计数试剂盒8（CCK8）评估细胞活性，结果显示“n.s”表示无显著性差异。c) BMDMs处理不同浓度（0、0.25、0.5和1 mg mL−1）的PLLA 72小时后，使用活细胞标记试剂Tubulin‐tracker对活细胞的微管蛋白进行染色。d) 使用MTT检测测量细胞活性，结果显示“n.s”表示无显著性差异。e, f) 通过Calcein‐AM/PI染色测量活细胞的百分比，结果“n.s”表示无显著性差异。g, h) 通过划痕实验检测PLLA对巨噬细胞迁移的影响，图中显示BMDMs划痕实验的代表性图像及统计分析结果。* 表示p < 0.05。i, j) 对F4/80标记的巨噬细胞（红色荧光）和荧光微球（绿色荧光）进行了双重免疫荧光染色，并统计每个巨噬细胞吞噬的微球数量。* 表示p < 0.05。

2.2. 巨噬细胞在体内和体外均促进乳酸诱导的成纤维细胞胶原合成

我们通过体内实验研究了巨噬细胞在乳酸诱导的胶原合成中的作用，实验使用小鼠模型，并在注射PLLA后通过氯膦酸脂质体（clodronate liposomes）耗竭巨噬细胞。在第30天收集皮肤样本，通过免疫荧光染色、Masson染色和蛋白质印迹（western blotting）检测胶原的生成情况（图2a）。我们的分析重点是研究巨噬细胞是否参与了皮肤中乳酸诱导的胶原合成。与正常皮肤相比，单独注射氯膦酸脂质体的小鼠皮肤中巨噬细胞密度显著降低，但胶原I和胶原III的水平未发生变化（图2b,c）。我们观察到，PLLA注射后，胶原I和胶原III的蛋白水平显著上调。值得注意的是，我们的研究发现，在乳酸刺激下，皮肤中的胶原生成（图2b,c）和胶原密度（图2b,d）显著增加，但这一现象在巨噬细胞耗竭后被逆转。为了进一步验证这一假设，我们对F4/80、胶原I和胶原III进行了蛋白质印迹分析（图2e,f）。随后，我们在体外建立了一个巨噬细胞-成纤维细胞共培养系统（图2g）。在上腔室中播种BMDMs（骨髓来源巨噬细胞），并添加或未添加PLLA，使其释放的乳酸和巨噬细胞分泌的细胞因子能够直接进入下腔室（图2g）。有趣的是，在PLLA添加后，巨噬细胞的存在显著增加了胶原I和胶原III的生成（图2h,i）。总体而言，这些结果表明，巨噬细胞在乳酸诱导的成纤维细胞胶原合成中起着至关重要的作用。

图2. 巨噬细胞在体内外均促进乳酸诱导的成纤维细胞胶原合成。a) 动物实验操作流程示意图，包括注射、取样及终止实验以进行组织学研究和蛋白质印迹分析。第1组为对照组；第2组仅注射氯膦酸盐脂质体；第3组仅注射PLLA；第4组联合注射PLLA与氯膦酸脂质体。PBS和生理盐水分别作为氯膦酸脂质体和PLLA的溶剂对照。b) 皮肤组织中I型胶原（红色荧光）与III型胶原（绿色荧光）免疫荧光染色、F4/80（绿色荧光）免疫荧光染色，蓝色荧光为DAPI核染色。各组Masson染色的组织学分析。c) 荧光强度相对值以第1组为基准进行标准化。* p < 0.05。d) Masson染色胶原相对密度定量分析。* p < 0.05。e,f) 皮肤样本蛋白质印迹分析，F4/80、I型胶原及III型胶原的相对蛋白表达量。* p < 0.05。g) 巨噬细胞-成纤维细胞体外共培养系统：巨噬细胞接种于上室，成纤维细胞接种于下室。h,i) 成纤维细胞（下室）中I型胶原与III型胶原的蛋白质印迹分析及其相对表达量定量。* p < 0.05。

2.3 巨噬细胞通过MCT1摄取乳酸和H4K12乳酸化修饰（H4K12la）响应乳酸刺激而增加

由于PLLA持续缓慢释放乳酸，我们检测了PLLA处理的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）无细胞上清液和全细胞裂解液（WCL）中的乳酸含量。结果显示PLLA处理的BMDMs其WCL中乳酸含量显著增加（图3a）。根据既往报道，乳酸可作为乳酸化修饰的底物[10]，我们发现PLLA能显著提高巨噬细胞中整体Kla水平（图3b,c）。通过FiLa传感器可视化乳酸水平[20]，可见PLLA处理的BMDMs细胞内乳酸水平明显高于对照组（图3d）。我们进一步探究乳酸含量上调是否会促进巨噬细胞的组蛋白乳酸化修饰。通过分析组蛋白中多个特征明确的乳酸化位点（包括H3K9la、H3K14la、H3K18la、H3K23la、H3K56la、H4K8la、H4K12la和H4K16la），发现H4K12位点的乳酸化水平在乳酸刺激下显著上调（图3e-g），该结果通过免疫荧光染色得到验证（图3h,i）。鉴于单羧酸转运蛋白（MCTs）已被报道参与乳酸转运[21]，我们首先采用qPCR检测0.5 mg mL−1 PLLA处理的BMDMs中MCT1-MCT14的转录水平。结果显示仅MCT1和MCT14的mRNA水平在PLLA处理组显著升高（图4a,b）。蛋白质印迹分析也证实PLLA处理的巨噬细胞中MCT1和MCT14蛋白表达增加（图4c,d）。为验证巨噬细胞是否通过MCT1/MCT14摄取乳酸，我们构建了三对MCT1 siRNA和两对MCT14 siRNA。蛋白质印迹显示MCT1 siRNA#2/#3能有效沉默MCT1表达，MCT14 siRNA#1/#2可沉默MCT14表达（图4e-h）。联合使用MCT1选择性抑制剂AZD3965发现，抑制MCT1会降低PLLA诱导的H4K12乳酸化水平（图4i,j）。siRNA沉默MCT1同样显著降低PLLA存在时的H4K12la水平（图4k,l），但沉默MCT14则不影响PLLA诱导的H4K12la升高（图4m,n）。综上表明，巨噬细胞通过MCT1摄取PLLA释放的乳酸，且H4K12乳酸化修饰可能是响应乳酸刺激诱导胶原合成的关键机制。

图3. 巨噬细胞中H4K12乳酸化修饰（H4K12la）响应乳酸刺激而增加。a) 骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）经0.5 mg mL−1 PLLA处理72小时后，检测处理组与对照组无细胞上清液及全细胞裂解液中的乳酸含量。"n.s"表示无统计学差异，* p < 0.05。b,c) 蛋白质印迹分析PLLA处理与未处理BMDMs中整体赖氨酸乳酸化（pan Kla）水平，相对表达量以β-actin为内参标准化。* p < 0.05。d) 采用FiLa传感器对0.5 mg mL−1 PLLA处理72小时的巨噬细胞进行荧光成像，显示细胞内乳酸分布。e-g) 蛋白质印迹检测PLLA处理与未处理BMDMs中组蛋白乳酸化位点（H3K9la、H3K14la、H3K18la、H3K23la、H3K56la、H4K8la、H4K12la和H4K16la）水平，各指标相对表达量以β-actin标准化。"n.s"表示无统计学差异，* p < 0.05。h,i) F4/80标记的巨噬细胞（绿色荧光）与H4K12la（红色荧光）双重免疫荧光染色，H4K12la荧光强度以对照组为基准定量。* p < 0.05。

图4. 巨噬细胞经PLLA处理后通过MCT1摄取乳酸。a,b) 

BMDMs中MCT1-MCT14的qPCR分析，mRNA水平以β-actin为内参标准化。"n.s"表示无统计学差异，* p < 0.05。c,d) 蛋白质印迹分析PLLA处理与未处理BMDMs中MCT1和MCT14蛋白表达，相对水平以β-actin标准化。* p < 0.05。e,f) 设计合成三对MCT1 siRNA，通过蛋白质印迹检测巨噬细胞中MCT1表达以验证沉默效率，相对表达量以β-actin标准化。"n.s"表示无统计学差异，* p < 0.05。g,h) 设计合成两对MCT14 siRNA，蛋白质印迹验证巨噬细胞中MCT14沉默效率，相对水平以β-actin标准化。* p < 0.05。i,j) 在PLLA存在条件下，使用MCT1抑制剂AZD3965或k,l) MCT1 siRNA抑制巨噬细胞MCT1，蛋白质印迹分析BMDMs中MCT1和H4K12la水平，相对表达量以β-actin标准化。* p < 0.05。m,n) 在PLLA存在时利用MCT14 siRNA抑制巨噬细胞MCT14，蛋白质印迹检测BMDMs中H4K12la水平，MCT14和H4K12la相对表达量以β-actin标准化。"n.s"表示无统计学差异，* p < 0.05。

2.4 乳酸化修饰酶KAT5与KAT8协同促进巨噬细胞H4K12la

为探究H4K12乳酸化的调控机制，我们通过蛋白质印迹检测了五种潜在乳酸转移酶（Kla writers）的表达水平，包括p300、KAT8、KAT2A、KAT5和AARS1。结果显示，与对照组相比，PLLA处理的BMDMs中KAT5和KAT8蛋白水平显著升高（图5a,b）。我们进一步构建了KAT8和KAT5的siRNA，并验证了其沉默效率（图5c-e）。为确认KAT5和KAT8是否负责将乳酰基从乳酰辅酶A转移至组蛋白H4K12位点，检测了沉默KAT8或KAT5后的H4K12乳酸化水平。值得注意的是KAT8敲除可完全消除PLLA诱导的H4K12乳酸化（图5f,g）。KAT5敲除同样能阻断PLLA介导的H4K12乳酸化（图5h,i）综上表明，KAT5和KAT8作为乳酸化修饰酶（Kla writers）协同促进巨噬细胞中H4K12的乳酸化修饰。

图5. 乳酸化修饰酶KAT5与KAT8协同促进巨噬细胞H4K12la。a,b) 蛋白质印迹分析PLLA处理72小时与未处理的BMDMs中潜在乳酸化修饰酶（p300、KAT8、KAT2A、KAT5和AARS1）表达水平，相对蛋白量以β-actin标准化。"n.s"表示无统计学差异，* p < 0.05。c-e) 蛋白质印迹检测转染siNC、siKAT8、siKAT5的BMDMs中KAT8和KAT5表达，相对蛋白水平以β-actin标准化。"n.s"表示无统计学差异，* p < 0.05。f,g) PLLA存在条件下KAT8敲除后BMDMs的H4K12la水平蛋白质印迹分析，相对H4K12la水平以β-actin标准化。* p < 0.05。h,i) PLLA存在条件下KAT5敲除后BMDMs的H4K12la水平蛋白质印迹分析，相对H4K12la水平以β-actin标准化。* p < 0.05。

2.5 RNA测序分析揭示ECM-受体相互作用与TGF-β信号通路参与巨噬细胞对乳酸刺激的响应

为探究巨噬细胞中调控乳酸诱导成纤维细胞胶原合成的潜在基因，我们对PLLA处理的BMDMs进行RNA测序以鉴定差异表达基因。分析结果显示共有528个基因上调、38个基因下调（图6a）。通过基因本体（GO）分析，这些上调基因主要富集于以下功能类别："发育过程"、"解剖结构发育"、"多细胞生物发育"及"系统发育"（图6b）。KEGG通路分析则显示上调基因显著富集于"TGF-β信号通路"、"细胞因子-细胞因子受体相互作用"和"ECM-受体相互作用"等通路（图6c）。进一步采用基因集富集分析（GSEA）对"ECM-受体相互作用"相关基因和"TGF-β信号通路"相关基因进行验证，并通过热图展示基因表达模式（图6d-g）。这些数据证实ECM-受体相互作用与TGF-β信号通路确实参与了巨噬细胞对乳酸刺激的响应过程。

图6. RNA测序分析揭示ECM-受体相互作用和TGF-β信号通路参与巨噬细胞对乳酸刺激的响应。a) BMDMs经0.5 mg ml−1 PLLA处理72小时后，以未处理细胞作为对照组进行RNA测序。结果显示BMDMs中有528个基因上调和38个基因下调，热图展示了对照组与PLLA处理组间的差异基因表达。b) 对上调表达基因进行GO富集分析。c) 对上调表达基因进行KEGG通路富集分析，重点显示其与ECM-受体相互作用和TGF-β信号通路等关键过程相关。d,e) GSEA分析显示ECM-受体相互作用与PLLA处理呈正相关，热图展示了参与ECM-受体相互作用的前20个上调基因。f,g) GSEA分析显示TGF-β信号通路与PLLA处理呈正相关，热图展示了参与TGF-β信号通路的前20个上调基因。

2.6 通过全基因组CUT&Tag分析鉴定H4K12la的潜在下游靶点

组蛋白乳酸化在调控靶基因转录中起重要作用。[10] 全基因组CUT&Tag是最近开发的用于研究蛋白质-DNA相互作用的方法。[22] 因此，我们进行了CUT&Tag分析以鉴定巨噬细胞中受H4K12la调控的候选基因。简而言之，BMDMs分别用0或0.5 mg mL−1的PLLA处理72小时。使用抗H4K12la抗体进行CUT&Tag分析（图7a），随后通过deep tools分析显示巨噬细胞中H4K12la峰值的富集（图7b）。对照组BMDMs和PLLA处理的BMDMs中上调的H4K12la结合峰的全基因组分布如图S2a（补充信息）所示。为了评估H4K12la在巨噬细胞中对乳酸刺激的表观遗传调控作用，通过GO和KEGG分析对具有差异结合峰的靶基因（图7c）进行分类。值得注意的是，我们发现上调的峰值相关基因富集于与"结合"、"细胞组分"、"蛋白质结合"、"细胞组分生物发生"和"黏着斑"相关的多种功能和通路中（图S2b，c，补充信息）。BMDMs中差异H4K12la结合峰的全基因组分布如图7d所示，其中11.95%的峰位于启动子序列内。通过结合CUT&Tag数据、RNA测序数据和来自公共开放数据库"Genecards"的基因集，鉴定出包括"Tgfb、Rbl1、Fbn1、Bmp..."在内的14个基因作为PLLA处理的巨噬细胞中H4K12la的潜在靶点（图7e）。有趣的是，CUT&Tag分析显示在TGF-β1和TGF-β3的启动子处H4K12la水平增加（图7f，g），而在HDAC3的启动子处观察到H4K12la水平降低（图7h）。此外，通过qPCR检测证实了TGF-β1、TGF-β3和HDAC3的mRNA水平。结果表明，在乳酸刺激的BMDMs中，TGF-β1和TGF-β3的表达水平显著上调，而HDAC3 mRNA水平显著降低（图7i，j）。

图7. 通过全基因组CUT&Tag分析鉴定H4K12la下游靶点。a) 实验流程示意图：BMDMs经0.5 mg mL−1 PLLA处理72小时后进行CUT&Tag分析，以鉴定H4K12la下游靶点。b) 使用deepTools可视化H4K12la结合密度：热图展示对照组与处理组BMDMs中不同H4K12la结合峰上的CUT&Tag标签计数。c) 火山图展示对照组与PLLA处理组BMDMs之间H4K12la结合峰的整体变化。d) 全基因组范围内分析对照组与PLLA处理组BMDMs之间差异H4K12la结合峰的分布情况。e) 生物信息学分析筛选出Tgfb作为巨噬细胞中H4K12la的下游靶点。f-h) IGV轨迹图展示CUT&Tag分析的TGF-β1、TGF-β3及乳酸化去除酶HDAC3的结合情况。i,j) qPCR检测PLLA处理BMDMs中TGF-β1、TGF-β3和HDAC3的mRNA表达水平。* p < 0.05。

2.7 巨噬细胞在乳酸存在下通过分泌TGF-β促进成纤维细胞胶原合成

我们随后研究了巨噬细胞中H4K12la调控的TGF-β是否作为影响成纤维细胞的关键效应分子。一方面，用0.5 mg mL−1 PLLA处理BMDMs 72小时后，收集无细胞上清进行分泌蛋白分析，采用考马斯亮蓝染色检测蛋白（图S3，补充信息）。同时进行4D非标记定量蛋白质组学分析（图S4a，支持信息），鉴定出TGF-β的三个肽段（ADHHATNGVVHLIDK、YLYSGQTLDTLGGK和YLYSGQTLDTLGGKK）（图S4b，补充信息）。用0.5 mg mL−1 PLLA处理后，收集BMDMs的无细胞上清和全细胞裂解液（WCL）进行TGF-β ELISA检测。结果显示，与对照组相比，PLLA处理的BMDMs在无细胞上清和WCL中的TGF-β浓度均显著增加（图8a,b）。另一方面，我们采用巨噬细胞-成纤维细胞共培养系统（图8c），通过siRNA转染敲低下室成纤维细胞中TGF-β受体（TGFβR1和TGFβR2）的表达（图S5，补充信息）。我们发现巨噬细胞的存在促进了PLLA处理后成纤维细胞中I型和III型胶原的水平。当成纤维细胞中TGFβR1和TGFβR2的表达被抑制时，这些效应被逆转（图8d,e）。此外，我们观察到PLLA处理后巨噬细胞中TGFβ1和TGFβ3蛋白水平显著增加，并分别构建了两对TGFβ1和TGFβ3 siRNA（图8f-h）。为进一步验证巨噬细胞来源的TGFβ1和TGFβ3分泌对成纤维细胞胶原合成的影响，共培养实验表明，在PLLA处理前敲低TGFβ1或TGFβ3会导致成纤维细胞胶原合成减少（图8i-k）。这些结果表明巨噬细胞通过分泌TGF-β促进成纤维细胞的胶原合成。

图8. 巨噬细胞在乳酸存在下通过分泌TGF-β促进成纤维细胞胶原合成。a,b) BMDMs经0.5 mg mL−1 PLLA处理72小时后，收集无细胞上清和全细胞裂解液（WCL）进行TGF-β ELISA检测。* p < 0.05。c) 体外共培养系统流程图：巨噬细胞接种于上室，成纤维细胞接种于下室，使用TGFβR1和TGFβR2 siRNA敲低下室成纤维细胞中TGF-β受体的表达。d,e) 蛋白质印迹分析下室成纤维细胞中I型胶原和III型胶原水平，相对蛋白量以β-actin标准化。* p < 0.05。f-h) 转染TGF-β1 siRNA或TGF-β3 siRNA的BMDMs经0.5 mg mL−1 PLLA处理后，蛋白质印迹检测BMDMs中TGF-β1和TGF-β3蛋白水平。"n.s"表示无统计学差异，* p < 0.05。i) 体外共培养系统示意图：巨噬细胞接种于上室，成纤维细胞在下室，使用TGF-β1和TGF-β3 siRNA敲低巨噬细胞中相应因子的表达。j,k) 蛋白质印迹分析下室成纤维细胞中I型胶原和III型胶原水平，相对蛋白量以β-actin标准化。* p < 0.05。

2.8 巨噬细胞中由H4K12la和HDAC3驱动的反馈环路激活TGF-β转录并促进成纤维细胞胶原合成

先前研究发现HDAC3是一种有效的组蛋白乳酸化去除酶(Kla-Eraser)[13]。我们假设存在一个反馈环路：乳酸刺激通过Kla writers KAT8和KAT5增加H4K12乳酸化，而HDAC3表达的降低随后促进H4K12乳酸化并增强TGF-β基因的转录，这对成纤维细胞的胶原合成至关重要(图9a)。为了证实乳酸-H4K12la-HDAC3反馈环路对巨噬细胞的功能影响，我们使用选择性激活剂ITSA-1在PLLA处理的BMDMs中激活HDAC3。HDAC3的激活导致H4K12乳酸化以及TGF-β1和TGF-β3表达显著降低(图9b,c)。同样，在PLLA存在下，过表达HDAC3的质粒增强了巨噬细胞中HDAC3的表达，同时降低了H4K12乳酸化以及TGF-β1和TGF-β3的表达(图9d,e)。此外，在巨噬细胞和成纤维细胞的共培养系统中，我们观察到通过使用ITSA-1激活HDAC3(图9f-h)或通过质粒转染过表达HDAC3(图9i-k)，可以抵消PLLA存在下巨噬细胞促进的成纤维细胞中I型和III型胶原的表达。这些结果表明，HDAC3激活破坏了巨噬细胞中乳酸-H4K12la-TGF-β轴，并抑制了乳酸刺激的成纤维细胞胶原合成。

图9. 巨噬细胞中H4K12la与HDAC3驱动的反馈环路激活TGF-β转录并促进成纤维细胞胶原合成。a) H4K12乳酸化(H4K12la)与Kla去除酶HDAC3驱动的反馈环路示意图，以及H4K12la与TGF-β的调控关系。b,c) 蛋白质印迹分析PLLA存在条件下，经或未经HDAC3激活剂ITSA-1处理的BMDMs中H4K12la、TGF-β1和TGF-β3水平，相对蛋白量以β-actin标准化。* p < 0.05。d,e) 蛋白质印迹分析PLLA存在条件下，转染或未转染HDAC3过表达质粒的BMDMs中HDAC3、H4K12la、TGF-β1和TGF-β3水平，相对蛋白量以β-actin标准化。* p < 0.05。f) 体外共培养系统：巨噬细胞接种于上室，在PLLA存在条件下经或未经HDAC3激活剂ITSA-1处理；成纤维细胞接种于下室。g,h) 蛋白质印迹分析下室成纤维细胞中I型胶原和III型胶原水平，相对蛋白量以β-actin标准化。* p < 0.05（参见f）。i) 体外共培养系统：巨噬细胞接种于上室，在PLLA存在条件下转染或未转染HDAC3过表达质粒；成纤维细胞接种于下室。j,k) 蛋白质印迹分析下室成纤维细胞中I型胶原和III型胶原水平，相对蛋白量以β-actin标准化。* p < 0.05（参见i）。

3.讨论

乳酸是一种重要的生物代谢物，在组织再生和修复过程中发挥关键作用。[9] 其在组织再生中的潜在功能包括：1) 能量供应：作为葡萄糖代谢副产物，乳酸可通过糖酵解途径在供氧不足时提供能量。组织再生修复期间细胞需要额外能量支持，乳酸可部分满足这一需求；[23] 2) 信号传导：乳酸可作为信号分子参与细胞间通讯。研究表明其能调控细胞代谢、增殖和分化，从而影响组织再生修复；[24] 3) 炎症调控：组织损伤或炎症后，乳酸积累可调节炎症反应。多项研究证实乳酸能调控免疫细胞活化，影响炎症反应的强度和持续时间。[25] 然而，乳酸促进胶原合成的具体机制及其在皮肤衰老中的作用尚不明确。

我们最新研究发现，乳酸通过KAT8介导的非组蛋白LTBP1乳酸化促进成纤维细胞胶原合成。[13] 组蛋白乳酸化作为新发现的乳酸依赖性表观遗传修饰，代表了一种通过蛋白质翻译后修饰调控基因转录的新机制。[10] 本研究发现，乳酸通过巨噬细胞与成纤维细胞的交互作用增强皮肤胶原生成。机制上，我们揭示了巨噬细胞中由H4K12乳酸化和HDAC3驱动的反馈环路，该环路响应乳酸刺激促进成纤维细胞胶原合成。乳酸可提高H4K12乳酸化水平并增强其与TGF-β基因启动子的结合。使用HDAC3激活剂或HDAC3过表达质粒处理可降低巨噬细胞H4K12乳酸化水平，并抑制成纤维细胞胶原合成。这些发现阐明了乳酸刺激、组蛋白乳酸化与胶原生成之间的机制关联，为抗皮肤衰老提供了潜在策略。

大量研究表明，乳酸与炎症相关疾病密切相关。例如，脓毒症患者血液乳酸水平显著升高[26]，细胞衰老会引发细胞内酸化导致乳酸水平上升[14]。这些研究提示过量乳酸可能对细胞不利。然而，我们近期报道通过注射聚左旋乳酸（PLLA）释放的低浓度乳酸可刺激皮肤成纤维细胞胶原合成[13]。PLLA作为一种可降解乳酸聚合物，能缓慢持续释放乳酸，对细胞具有高度安全性[12]。我们前期研究发现PLLA降解72小时后细胞培养基中乳酸含量约为0.06 µmol mL−1[13]。巨噬细胞作为重要免疫细胞，能响应外来物质或炎症刺激，并在环境信号调控其他细胞行为中发挥关键作用[17]。鉴于PLLA注射后会引发巨噬细胞浸润[27]，我们推测胶原合成可能受巨噬细胞调控。本研究发现PLLA处理对巨噬细胞安全且不影响其存活率，其迁移和吞噬能力随PLLA剂量增加而增强。氯膦酸脂质体通过干扰代谢活性诱导巨噬细胞凋亡或失活，被广泛用于巨噬细胞清除[28]。PLLA注射后采用腹腔注射氯膦酸脂质体清除巨噬细胞，发现巨噬细胞缺失会降低乳酸刺激的皮肤胶原合成，该结果在体外共培养系统中得到进一步验证，表明巨噬细胞对乳酸诱导的胶原合成不可或缺。乳酸作为乳酸化修饰底物，通过赵教授团队开发的FiLa乳酸传感器[20]检测发现PLLA处理后巨噬细胞内乳酸水平显著升高。我们的研究证实乳酸通过单羧酸转运蛋白1（MCT1）通道进入细胞后促进H4K12乳酸化水平升高。MCT1作为跨膜蛋白在乳酸跨膜转运中起关键作用，主要负责乳酸等单羧酸的转运[23]。其以乳酸/H+共转运模式工作，既能外排乳酸又能摄取外源乳酸，对维持细胞内外的乳酸平衡至关重要[29]。乳酸化修饰的发现为蛋白质翻译后修饰提供了新视角。赖氨酸乳酸化过程涉及乳酸转化为乳酰辅酶A后，在酰基转移酶作用下乳酰基与赖氨酸侧链结合[10]。p300和KATs（如KAT8、KAT2A和KAT5）是哺乳动物细胞中两类代表性组蛋白/赖氨酸乙酰转移酶（HAT/KAT）[30-32]。最新研究表明这些酶具有多种酰基转移活性，包括乙酰化和乳酸化。此外，丙氨酰-tRNA合成酶（AARS1）也被鉴定为新型乳酸传感器并具有乳酰转移酶功能[15]。本研究发现PLLA处理的巨噬细胞中KAT8和KAT5水平显著升高，沉默任一酶都会降低H4K12乳酸化，表明KAT8和KAT5协同介导乳酸刺激下的乳酰辅酶A转移。

已知组蛋白乳酸化可调控基因转录。通过CUT&Tag分析（一种酶介导的高效、高分辨率测序技术，用于解析染色质组分[22]），我们发现巨噬细胞中TGF-β1和TGF-β3基因启动子区H4K12la显著富集，这与促进成纤维细胞胶原合成密切相关。TGF-β属于转化生长因子家族，通常由成纤维细胞表达，是调控基质合成与胶原生成的关键因子[33]。值得注意的是，本研究发现乳酸刺激后，巨噬细胞中TGF-β1和TGF-β3水平受H4K12乳酸化调控而显著升高。巨噬细胞分泌的TGF-β可通过TGF-β受体（TGFβR）进入成纤维细胞，这一机制通过敲低成纤维细胞TGFβR表达及4D非标记定量蛋白质组学鉴定PLLA处理巨噬细胞无细胞上清蛋白得到证实。

与其他翻译后修饰调控机制类似，乳酸化受多种调节酶调控，包括乳酸转移酶（常称为"writers"）和去乳酸化酶（称为"erasers"）[34]。组蛋白去乙酰化酶HDAC3此前已被鉴定为有效去乳酸化酶[13]。本研究发现乳酸刺激导致巨噬细胞HDAC3表达水平下降，CUT&Tag分析更显示HDAC3启动子区H4K12la富集程度降低，由此我们推测H4K12la与HDAC3之间存在反馈环路。乳酸化可能通过影响组蛋白与特定基因启动子的结合来调控其转录[26]。使用选择性激活剂ITSA-1[35]激活HDAC3后，H4K12乳酸化水平降低并抑制巨噬细胞下游靶基因TGF-β的转录，从而在PLLA存在时阻断成纤维细胞胶原合成。因此我们提出：乳酸化通过调控H4K12与HDAC3启动子的结合来调节其表达。研究结果表明，乳酸作为皮肤成纤维细胞胶原合成的刺激因子，其乳酸-H4K12la-HDAC3轴在巨噬细胞中发挥核心作用，调控TGF-β的表达与分泌。

需指出本研究的局限性：首先，乳酸处理的成纤维细胞对巨噬细胞的影响需进一步探究；其次，使用巨噬细胞特异性基因敲除小鼠将更深入揭示乳酸促进皮肤胶原合成的作用机制。

4.结论

总之，我们的研究结果表明，低浓度乳酸通过巨噬细胞与成纤维细胞的细胞间相互作用，成为刺激成纤维细胞胶原合成的激活剂。在使用持久缓释乳酸源PLLA后，巨噬细胞被募集，乳酸促进H4K12乳酸化以响应PLLA。此外，我们还研究了巨噬细胞中H4K12乳酸化与赖氨酸去乳酸化酶HDAC3之间的反馈环路，该环路调控巨噬细胞中TGF-β的产生和成纤维细胞的胶原合成。这些发现表明，乳酸是皮肤胶原合成的有效刺激因子，乳酸-H4K12乳酸化-HDAC3-TGF-β轴代表了抗皮肤衰老干预的新靶点（图10）。

图10. 本研究提出巨噬细胞通过"乳酸-H4K12la-HDAC3-TGF-β"轴参与乳酸诱导成纤维细胞胶原合成的作用模型。图10所有示意图均通过BioRender.com平台绘制（https://biorender.com/）

5.实验部分

伦理审批声明

所有动物实验均经暨南大学附属广东省第二人民医院机构动物护理与使用委员会批准（审批编号：2022‐DE‐KZ‐007‐01）。

细胞培养与处理

人包皮成纤维细胞（BJ）和小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），培养于含10%胎牛血清（FBS，货号FSP500，ExCell Bio，中国）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（货号15140122，Invitrogen，美国）的高糖DMEM培养基（货号11965118，Gibco，美国）。骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）的分离与培养参照文献[36]方法：用DMEM冲洗6-8周龄小鼠胫骨与股骨骨髓腔获取细胞，随后在含10% FBS和20 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（MCSF，货号RP01216，艾博抗，中国）的高糖DMEM中，于37℃、5% CO2条件下培养7天，并通过巨噬细胞标志物F4/80免疫荧光鉴定。RAW264.7与BMDMs分别用0、0.25、0.5和1 mg/mL聚左旋乳酸（PLLA）培养基稀释液处理72小时。另采用10 µM HDAC3激活剂ITSA-1在PLLA存在条件下增强HDAC3表达，并使用250 nM MCT1抑制剂AZD3965抑制巨噬细胞中MCT1活性。

细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、MTT法及钙黄绿素-AM/PI染色

采用 CCK-8 试剂盒（货号 C0037，碧云天，中国）和 MTT 法（货号 C0009S，碧云天，中国）检测细胞活力。将 RAW264.7 细胞 或 BMDMs 以每孔 5000 个细胞的密度接种于 96 孔板，并用 PLLA 处理。随后，每孔加入 10 µL CCK-8 试剂，置于 37°C、5% CO₂ 避光孵育 2 小时，使用酶标仪（货号 Synergy HTX，BioTek，美国）测定吸光度（OD 值）。BMDMs 以每孔 5000 个细胞的密度接种于 96 孔板，经 PLLA 处理后，每孔加入 50 µL 新鲜配制的 MTT 溶液（5 mg/mL），继续 37°C 孵育 4 小时。孵育完成后，弃去上清，每孔加入 100 µL 溶解液 溶解甲臜结晶，随后用酶标仪在 570 nm 波长下测定 OD 值。此外，采用 钙黄绿素-AM/PI 染色 进行活/死细胞双染。细胞首先用 0.4 µM 绿色荧光染料钙黄绿素-AM（货号 BB-4126，BestBio，中国）于 37°C 避光孵育 30 分钟 标记活细胞（绿色荧光），随后用 2 µM 红色荧光染料碘化丙啶（PI）（货号 BB-4126，BestBio，中国）于 37°C 避光染色 5 分钟 标记死细胞（红色荧光）。染色完成后，在 荧光显微镜（Zeiss，德国）下观察，并在 400 µm × 400 µm 视野 内进行细胞计数分析。

划痕愈合实验

采用划痕实验评估细胞迁移能力。简要步骤如下：将密度为 2×10⁶/mL 的 BMDMs 接种于 6孔板，并分别用 0.25 mg/mL 或 0.5 mg/mL PLLA 处理。24小时后，用无菌移液枪头在孔板中央区域划出无细胞带，分别于划痕后 12小时 和 24小时 通过 相差显微镜（Zeiss，德国）拍摄划痕区域。使用 Image J软件（Media Cybernetics，美国）定量分析划痕面积变化。

巨噬细胞吞噬功能检测

为评估乳酸刺激下巨噬细胞的吞噬能力，将 BMDMs 以 1×10⁵细胞/孔 的密度接种于 24孔板，并分别用 0.25 mg/mL 或 0.5 mg/mL PLLA 处理。随后，向细胞中加入 0.1 mg/mL 荧光微球（直径1 µm，货号7‐3‐0100，基尔顿生物，中国），孵育后以 PBS洗涤3次 去除未内化微球。固定细胞（4%多聚甲醛）并用 F4/80抗体标记巨噬细胞轮廓，最后统计单个巨噬细胞内吞的荧光微球数量。

实验动物及药物注射方案

12月龄雄性C57BL/6小鼠购自赛业生物（苏州）。聚左旋乳酸（PLLA，LaSynPro，中科生 biom）使用前以无菌生理盐水配制成50 mg/mL浓度溶液。实验动物分为四组（每组3只），经180 mg/kg三溴乙醇（货号T48402，Sigma Aldrich，美国）麻醉后剃除背部毛发。每只小鼠使用注射器在背部真皮层注射100 μL PLLA溶液，对照组注射等量生理盐水。为清除巨噬细胞，实验组在PLLA注射前1天腹腔注射100 μL氯膦酸脂质体（货号40337ES05/10，翌圣生物），并于PLLA注射后第2、3天补充注射；对照组同期注射PBS。第30天时，采用呼吸麻醉实施安乐死并采集背部皮肤组织用于后续实验。

巨噬细胞-成纤维细胞共培养系统

采用共培养小室（JET Biofil，中国）进行细胞共培养。将1×10⁵/mL的BMDMs接种于上层小室，2×10⁵/mL的成纤维细胞接种于下层小室。为研究PLLA存在下巨噬细胞对成纤维细胞胶原合成的影响，BMDMs分别进行PLLA处理或不做处理。为探究巨噬细胞分泌的TGF-β是否促进成纤维细胞的胶原合成，上层小室中的巨噬细胞分别转染TGF-β1或TGF-β3，同时下层小室中的成纤维细胞转染TGFβR1和TGFβR2以抑制TGF-β受体。本研究所用siRNA序列详见附表S1（补充材料）。

乳酸水平检测及FiLa传感器乳酸可视化实验

收集经PLLA处理的BMDMs培养72小时后的无细胞上清液及全细胞裂解液（WCL）用于乳酸检测。采用乳酸检测试剂盒（货号BL868A，Biosharp，中国）定量测定乳酸水平，具体操作按说明书进行，并基于标准曲线计算浓度值。此外，使用超灵敏乳酸传感器FiLa进行细胞内乳酸可视化检测。FiLa与FiLa-C质粒由赵玉正教授惠赠。病毒包装流程如下：采用Lipofectamine 3000（货号L3000015，Invitrogen，美国）将FiLa-C和FiLa质粒与psPAX2包装质粒、Pmd2.G包膜质粒共转染HEK293T细胞。72小时后收集病毒上清，经超速离心浓缩纯化后用于巨噬细胞转染。BMDMs细胞内乳酸可视化操作：将细胞接种于35mm玻底培养皿，病毒上清与培养基按1:1比例混合后加入培养皿。转染3-4天后，通过荧光显微镜观察BMDMs中绿色荧光表达。随后用嘌呤霉素筛选48小时，更换新鲜培养基后，使用Zeiss共聚焦激光扫描显微镜进行双激发比率成像（405nm激发激光配合488nm激发激光，发射波长500-550nm）采集图像。

体外siRNA及质粒转染实验

采用特异性siRNA试剂（中国Tsingke Biotechnology公司，序列信息见表S1）分别沉默BMDMs中的MCT1、MCT14、KAT8、KAT5基因以及人成纤维细胞中的TGFBR1和TGFBR2基因。使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂（货号13778150，美国Thermo Fisher公司）进行siRNA转染。HDAC3过表达质粒（pECMV-Hdac3-m-FLAG）购自MIAOLING BIOLOGY公司（货号P5690），采用Lipofectamine 3000转染试剂（货号L3000015，美国Invitrogen公司）将质粒转染至BMDMs中。

RNA测序、CUT&Tag及生物信息学分析

采用Trizol法提取总RNA，使用Illumina TruSeq RNA样本制备试剂盒构建mRNA文库，并在DNBSEQ-T7平台（中国华大基因）进行测序。差异表达基因（DEGs）的筛选标准为：错误发现率（FDR）<0.01、表达量变化倍数<0.5或>2.0、P值<0.05。CUT&Tag实验采用CUT&Tag检测试剂盒（货号CUT-02，中国若羽生物）进行。具体步骤：将BMDMs以1×10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板，用0.5 mg/mL PLLA处理72小时后，依次进行以下操作：(1)室温下与ConA磁珠及兔源抗H4K12la抗体（1:100稀释）孵育2小时；(2)洗涤后与兔源二抗室温孵育1小时；(3)加入pA-Tn5转座酶获取目标DNA片段，并使用接头引物进行PCR扩增。PCR产物经DNA磁珠（货号DB-01，中国若羽生物）纯化后用于文库构建、测序及生物信息学分析（中国派森诺生物）。文库构建所用引物对详见表S2（补充材料）。

5.1.非标记定量蛋白质组学分析

采用0.5 mg/mL PLLA处理BMDMs细胞72小时后，10000×g离心15分钟收集无细胞上清液，用于4D非标记定量蛋白质组学分析以鉴定乳酸刺激下巨噬细胞的蛋白分泌谱。蛋白提取后使用考马斯亮蓝染色试剂（货号P0003，中国碧云天）进行检测。胰蛋白酶消化及LC-MS/MS分析由中国派森诺生物技术有限公司完成，质谱数据采用MaxQuant软件进行处理。

实时定量PCR（qPCR）实验

使用Trizol法提取总RNA后，采用qPCR RT试剂盒（货号FSQ-101，日本Toyobo）合成cDNA。随后使用SYBR Green荧光染料（货号FP205，中国天根，北京）进行定量PCR检测，退火温度设置为55℃。采用2^−△△Ct

方法计算各基因相对于β-actin的表达量比值，实验所用引物序列详见表S3（补充材料）。

免疫荧光染色

组织样本经4%多聚甲醛固定后，30%蔗糖溶液脱水过夜，OCT包埋进行冰冻切片。细胞样本经4%多聚甲醛固定后，经透化及封闭处理，4℃条件下与一抗（见表S4，补充材料）孵育过夜，室温下与二抗（见表S4，补充材料）孵育2小时。

Masson染色

皮肤切片用PBS冲洗三次后，用Mayer苏木精染色5分钟。随后在70%酒精配制的0.5%盐酸中分化5秒，流水冲洗30秒，再用蒸馏水漂洗两次。切片随后用酸性品红染色5分钟，蒸馏水漂洗三次，在1%磷钼酸水溶液中处理5分钟，再用1%苯胺蓝复染5分钟，最后用1%冰醋酸分化5分钟。切片经乙醇脱水、二甲苯透明后封片。胶原纤维呈蓝色染色，使用Image J软件分析染色强度。

Western blotting实验

蛋白样品用含蛋白酶抑制剂混合物（货号HY-K0010，美国MCE）的裂解液制备，通过SDS-PAGE电泳分离蛋白。本研究使用的特异性一抗和相应二抗信息详见表S4（补充材料）。

数据统计与分析

数据以均值±标准误表示。两组间比较采用双侧非配对t检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较检验，使用Origin软件进行统计分析。统计学显著性设定为p < 0.05。

伦理审批声明

本研究所有实验方案均经暨南大学附属广东省第二人民医院伦理委员会批准。

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