聚-L-乳酸微球延缓大鼠皮肤表皮干细胞的衰老

董云先^{1, 2, +}，张有良^{2, +}，于昊^{2, +}，周玲聪²，张雅安²，汪海滨^{2, *}，胡志成^{3, *}罗盛康^{2, *}

¹南方医科大学南方医院整形美容外科，广东广州

²广东省第二人民医院整形美容科，广东广州

³中山大学附属第一医院烧伤与创面修复与重建科，广东广州

目的：可注射皮肤填充剂为皮肤抗衰老和面部年轻化提供了更为多样的选择。聚左旋乳酸（PLLA）微球因其可降解性和持久性，越来越受到青睐，成为常用的填充材料。目前已有研究主要关注PLLA对真皮胶原蛋白的影响，而未探究其对表皮的作用。在本研究中，我们考察了PLLA微球对表皮干细胞（EpiSCs）的影响。

方法：通过体外培养，将不同浓度的PLLA微球作用于表皮干细胞（EpiSCs），并对原代大鼠EpiSCs进行鉴定。采用CCK-8检测、凋亡染色、流式细胞术、Transwell小室实验、划痕愈合实验、q-PCR分析以及免疫荧光染色等方法，评估PLLA对EpiSCs的影响。此外，我们还通过将PLLA注射至大鼠皮肤真皮层，进一步观察其对表皮的影响。

结果：PLLA微球可促进细胞增殖与迁移，同时延缓细胞衰老并维持其干性。在体外实验中，PLLA微球经皮内注射至大鼠背部皮肤后，表现出延缓皮肤老化的作用。通过对注射部位在第2、4及第12周进行的组织学及免疫组化染色分析，进一步验证了其抗衰老效果。

结论：本研究表明，PLLA对大鼠表皮组织及表皮干细胞（EpiSCs）具有积极作用，并为揭示PLLA的抗衰老机制提供了新的研究视角。

关键词：聚-L-乳酸，表皮干细胞，皮肤老化，抗衰老，中胚层疗法

1. 介绍

皮肤老化是人体一种自然且不可避免的生理过程，表现为表皮细胞和成纤维细胞的数量及功能下降，以及弹性蛋白和胶原蛋白的合成减少和萎缩（1）。皮肤老化的生理表现包括皮肤变薄、萎缩、干燥、皱纹逐渐加深、弹性丧失，并常伴有瘙痒和色素沉着不均（2）。这些变化日益影响人们对美的追求，尤其是对面部皮肤老化的关注不断上升。因此，延缓皮肤老化进程和实现面部年轻化的策略，已成为美容与时尚行业以及整形外科领域高度关注的研究方向（3，4）。

表皮老化在皮肤与年龄相关的结构和功能变化中起着关键作用，因为表皮对于维持皮肤健康及抵御外部环境应激具有重要意义（5，6）。表皮主要由角质形成细胞和基底细胞组成，这些细胞在维持皮肤稳态、抵御物理、化学及病原体损伤方面发挥着核心作用（7，8）。位于基底层的表皮干细胞（EpiSCs）是表皮自我更新的重要“种子”细胞（9，10）。在皮肤创伤修复过程中，EpiSCs亦表现出强大的再生修复能力（11，12）。在单细胞水平上，稳态皮肤中表达COL17A1高水平的基底细胞在被激活后能够促进基底层细胞的分化并加速伤口愈合（13）。通过COL17A1蛋白水解过程，EGFR介导的EpiSCs运动性可驱动皮肤再生，为与年龄相关的皮肤损伤修复提供了新的治疗思路（14）。EpiSCs数量的减少可能导致角质形成细胞分化能力下降，从而引起皮肤变薄（15）。年轻皮肤中的基底膜带呈波浪状，而随着年龄增长，该结构趋于平坦，进而削弱了皮肤的结构完整性和机械稳定性（16）。

目前，填充剂注射已成为实现面部年轻化的主要手段（17–19）。当前应用最广泛的可降解真皮填充剂主要包括交联透明质酸（HA）和促胶原生成类填充剂（20）。其中，聚左旋乳酸（PLLA）等促胶原填充剂因其效果可持续长达2年，受到广泛欢迎并已在临床中得到广泛应用（21，22）。在机制方面，最新研究表明，PLLA可通过持续的炎症反应及促进M2型巨噬细胞极化的持续激活，从而诱导成纤维细胞产生胶原蛋白（23）。补充或新生的胶原蛋白可有效紧致皮肤、减少皱纹，从而发挥显著的抗衰老作用（24，25）。

水光针疗法是一种将填充剂注射至真皮层的治疗方式，被认为能够提升皮肤的光泽度与活力（26，27）。然而，传统的PLLA注射通常靶向于真皮下层，而非中胚层。目前的研究主要集中于PLLA对真皮层的影响，对于其对表皮层，尤其是表皮干细胞（EpiSCs）的作用尚缺乏深入探讨（28）。本研究旨在探究PLLA对大鼠EpiSCs体外生物学功能的影响，并评估其皮内注射后对大鼠皮肤老化的干预效果。

2. 方法

2.1 PLLA的体外降解

首先，将PLLA（Löviselle，SinoBiom，中国长春；规格：340 mg/5 mL）置于1%磷酸盐缓冲液（PBS，10010023，Gibco）中分别孵育10、20和30天，通过光学显微镜观察微球的形态学变化。此外，还对微球的直径进行了统计测量。由于后续实验中将使用表皮干细胞（EpiSCs），因此亦考察了PLLA微球在EpiSCs专用培养基（角质形成细胞无血清培养基，K-SFM，17005042，Gibco）中的形态变化。

2.2 大鼠表皮干细胞（EpiSCs）的分离与培养

取6周龄Sprague–Dawley（SD）大鼠的背部皮肤，剪取后置于含有1% PBS的15 mL离心管中。去除筋膜层，仅保留完整的表皮与真皮组织。随后将皮肤剪切成1 × 1 cm²的小块，置于2 mL含有×10浓度Tryple消化液（A1217702，Gibco）中，于37°C条件下消化30分钟。消化完成后，使用无菌手术刀片与镊子将表皮与真皮组织小心分离，以获得表皮组织。

对于EpiSCs的提取，将分离出的表皮组织置于0.25%胰酶溶液中，于37°C下消化约5分钟。随后，轻轻涡旋、振荡，并通过70 μm细胞筛过滤，以1500 rpm的速度离心5分钟，获得以表皮基底细胞为主的细胞沉淀。所得的原代皮肤干细胞悬浮于角质形成细胞无血清培养基（K-SFM）中，并接种于已用纤维连接蛋白（FN，5 μg/cm²，上海Fibronectin生物科技有限公司，中国）包被的培养瓶中。在37°C孵育2小时后，更换培养基，仅保留贴壁细胞，即可鉴定为原代EpiSCs。

对于成纤维细胞的获取，将分离出的真皮组织置于Ⅲ型胶原酶（S10054，0.8 mg/mL，Yuanye，中国）中，于37°C下消化6小时。消化完成后，过滤去除未完全消化的组织块，收集所得细胞悬液，离心并弃去上清液。随后，将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中，并转移至培养皿进行进一步培养，以便获得真皮成纤维细胞。

2.3 免疫荧光染色

EpiSCs在共聚焦显微镜专用玻底培养皿中按不同处理方式培养48小时。随后，使用4%多聚甲醛固定细胞20分钟，0.25% Triton X-100通透20分钟，37°C下以0.5%山羊血清封闭1小时，并于4°C下与一抗孵育过夜。洗涤后，细胞与荧光标记的二抗在室温下孵育1小时，并用DAPI共染核染色15分钟。荧光信号通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，LSM880 Basic Operation，Zeiss）采集。所用一抗包括：抗Integrin-α6（1:200，ab235905，Abcam）、抗细胞角蛋白19（CK19，1:400，ab84632，Abcam）、抗细胞角蛋白15（CK15，1:400，ab80522，Abcam）、抗CD71（1:400，ab22391，Abcam）、抗CD31（1:400，ab24590，Abcam）、抗CD34（1:400，ab81289，Abcam）。所用二抗包括：山羊抗小鼠IgG（1:500，SA00009–1，Proteintech）和山羊抗兔IgG（1:500，SA00009–2，Proteintech）。用于EpiSCs鉴定的细胞为第2代传代细胞。

2.4 流式细胞术

为鉴定EpiSCs，收集第三代细胞并用PBS清洗后，采用BD Cytofix/Cytoperm™ 固定/通透化试剂盒对细胞进行固定和通透处理。加入3 mL孵育缓冲液，洗涤后离心收集细胞。在每个流式管中，将细胞重悬于100 μL孵育缓冲液中，于室温下封闭10分钟。随后加入一抗，于室温下孵育1小时。再加入荧光标记的二抗，于室温下孵育30分钟。最后用孵育缓冲液离心洗涤细胞，并通过流式细胞仪进行分析。所用一抗包括：p63（Abcam，ab124762，1:200）和α6-integrin（Abcam，ab77906，1:200）。

为了检测细胞凋亡情况，将EpiSCs接种于6孔板中并培养过夜。随后分别向各孔中加入PLLA微球，使其终浓度为0、250、500、2000 µg/mL，置于培养箱中孵育6小时。之后继续在37°C条件下培养24小时。细胞经PBS洗涤后收集，使用Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI，4abio，中国）在避光条件下染色。染色完成后，使用流式细胞仪对样本进行检测与分析。

2.5 CCK-8细胞活力检测

将EpiSCs以3×10³个细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养过夜。随后分别给予不同剂量的PLLA处理（0、50、100、250、500、750、1000 和 2000 μg/mL），每组设置三重复孔。细胞于培养箱中孵育24–48小时后，按照CCK-8试剂盒（Fudebio，杭州，中国）说明书进行操作，检测细胞活力。

2.6 活细胞/死细胞染色

将EpiSCs接种于6孔板中培养，当细胞融合度达到90%时，分别加入不同浓度的PLLA（0、250、500、2000 μg/mL）。孵育48小时后，用PBS清洗细胞3次，然后加入Calcein-AM/碘化丙啶（PI）染色液，染色30分钟。染色后，使用荧光显微镜观察细胞活性情况。

2.7 Transwell迁移实验

EpiSCs经离心后重悬于无血清培养基中，取200 μL细胞悬液（约5000个细胞）加入至未涂胶的Transwell小室中，下腔室则加入600 μL含20% FBS的完全培养基。孵育24小时后，取出Transwell小室，擦除未迁移的细胞。随后，使用多聚甲醛固定细胞20分钟，再用0.1%结晶紫染色30分钟。染色结束后，在显微镜下拍照并计数迁移细胞。如图1A所示，表皮干细胞种植于上室，不同处理条件设置于培养皿下室，分为如下四组：①对照组；②PLLA处理组；③成纤维细胞组；④成纤维细胞 + PLLA组。上述实验操作在细胞第3代至第6代过程中持续进行。

图1 聚左旋乳酸（PLLA）微球对表皮干细胞迁移与衰老的影响。（A）实验示意图；（B）不同处理组EpiSCs的Transwell迁移实验图像；（E）迁移实验的统计分析结果。（C）伤口愈合实验示意图；（D）不同处理组EpiSCs的伤口愈合图像；（F）愈合效果的统计分析结果。（G）各组β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色图像；（H）各组p16与p21 mRNA表达水平的qPCR分析结果。数据以均值±标准差（mean ± SD）表示。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，ns表示差异无统计学意义。

2.8 伤口愈合实验

将EpiSCs培养至单层融合度达到90%，使用吸管尖在单层细胞上划出一道划痕。用PBS清洗去除未附着细胞后，继续培养48小时。之后对每孔单层细胞的划痕愈合情况进行拍照，并利用ImageJ软件计算伤口愈合百分比。对于这一部分（图1C），培养皿底部被EpiSCs覆盖，对上室给予不同的处理：①对照组；②PLLA组；③成纤维细胞组；④成纤维细胞+ PLLA组。上述实验处理从第3代细胞持续进行至第6代。

2.9 β-半乳糖苷酶活性检测

EpiSCs在6孔板中接受不同处理并培养24小时。随后按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒（G1580，Solarbio）的说明进行细胞固定和染色，并于37°C避光条件下孵育过夜。染色结束后，使用光学显微镜对细胞进行拍照观察。细胞从第3代到第6代连续按照“伤口愈合实验”中提到的方法进行处理。

2.10 实时定量PCR（RT-qPCR）

使用RNA Easy Fast Tissue/Cell试剂盒（TIANGEN，中国）提取EpiSCs总RNA，并按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific，美国）说明书反转录为cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix（Toyobo，日本）和特异性引物，在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR系统（Bio-Rad，美国）上进行RT-qPCR，检测目标基因的mRNA表达水平，相对表达量以GAPDH为内参进行标准化。细胞从第3代到第6代连续按照“伤口愈合实验”中提到的方法进行处理。引物序列如下（29, 30）：

P16-Forward: 5’-TCCTTGGCTTCACTTCTGGCAAC-3’

P16-Reverse: 5’-TCCTTGGCTTCACTTCTGGCAAC-3’

P21-Forward: 5’-GAAAACGGAGGCAGACCAG-3’

P21-Reverse: 5’-TTCAGGGCTTTCTCTTGCAG-3’

Integrin-α6-Forward: 5′-GTCACCTTTGACACCCCAGATC-3′

Integrin-α6-Reverse: 5′-CAACTGTACCTCCAAAATACACC-3′

GAPDH-Forward: 5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’

GAPDH-Reverse: 5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’

2.11 动物实验与建模

将16只雄性SD大鼠（六周龄，体重280–300克）随机分为2组。实验前，使用2%戊巴比妥钠（0.25 mL/100 g）腹腔注射进行麻醉。背部剃毛后，在图2A和2B所示的标记区域进行注射：左侧三个区域注射PLLA，右侧相应区域注射生理盐水。每个区域注射4个点，每点注射0.1 mL PLLA或生理盐水。各组大鼠分别在第0、2、4和12周处死，取皮肤组织进行染色分析。本研究中注射深度位于真皮内，即中胚层，区别于常规的皮下层注射。

图2 大鼠真皮中层注射PLLA微球。（A）SD大鼠注射PLLA后的实拍图像；（B）中胚层注射及动物实验的示意图；（C）大鼠皮肤在皮下注射（常规注射）与真皮内注射（中胚层疗法）PLLA微球后的HE染色图像。

2.12 组织学分析

取下的大鼠耳组织经10%中性福尔马林固定过夜后，进行石蜡包埋。组织切片厚度为5 μm，进行苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）染色。染色后的切片在光学显微镜下观察并拍照记录（数字病理切片扫描仪，KFBIO，中国，KF-PRO-020-HI）。IHC染色所用一抗为抗CK19抗体（1:400，ab76539，Abcam）；二抗为即用型HRP标记的山羊抗小鼠抗体（PR30012，Proteintech）。

2.13 统计分析

两组之间的差异采用非配对t检验分析，多组之间的差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Bonferroni事后校正进行比较，分析软件为SPSS 24.0。P值<0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1 PLLA微球的降解

首先观察了PLLA微球在体外的降解情况。当微球在PBS中分别放置10、20和30天后，仍主要保持其球形结构（图3A、D）。随后对微球的直径进行了测量，结果显示直径在31–40 μm之间的微球比例从31.0%下降至14.7%，而直径小于20 μm的微球比例则从30.7%上升至52.0%（图3B）。上述结果提示PLLA微球的直径随时间逐渐减小，可能表明其经历了缓慢的降解过程，这与先前报道的持续降解模式相符。进一步地，还检测了PLLA微球在EpiSCs专用培养基K-SFM中的降解情况，结果与PBS组相似（图3D、E），但在K-SFM中，PLLA微球的降解速度更快。

此外，部分PLLA微球随时间推移表现出凹陷或杯状的形态，且这类杯状结构的比例逐渐上升（图3C、F）。这些发现提示，除了表现出缓慢降解特性外，PLLA微球可能还通过裂纹的产生而发生结构性降解（31）。

图3 PLLA微球在PBS和K-SFM中的降解情况。(A) PBS中第0、10、20和30天时PLLA微球的光学显微镜图像。(B) PBS中不同时间点PLLA微球直径分布的统计分析。(C) PBS中杯状PLLA微球所占比例的统计分析。(D) K-SFM 中第0、10、20和30天时 PLLA 微球的光学显微镜图像。(E) K-SFM中不同时间点PLLA微球直径分布的统计分析。(F) K-SFM中杯状PLLA微球所占比例的统计分析。黄色箭头：杯状PLLA微球。

3.2 表皮干细胞（EpiSCs）的表征与鉴定

我们之前的研究已成功建立了大鼠表皮干细胞（EpiSCs）的分离方法（32，33）。随后对所分离的表皮干细胞进行了表征。如图4A所示，原代EpiSCs在K-SFM培养基中培养3天后，在光学显微镜下可见其呈鹅卵石状形态，细胞核较大。到第7天时，EpiSCs呈现出类似“铺路石”的排列方式，细胞间连接紧密（图4B）。当前被广泛认可的 EpiSCs鉴定标志物包括 Integrin-α6、CK15、CK19 和 p63（34–36）。在培养至第三代后，采用免疫荧光和流式细胞术对其特异性标志物及纯度进行鉴定。免疫荧光分析显示，EpiSCs高表达多种基底膜相关标志物，包括 Integrin-α6、CK15、CK19及 CD71（图4C）。此外，阴性对照中未检测到CD31和CD34的表达，证实所分离的细胞不是血管内皮细胞（图4C）。流式细胞术结果显示，Integrin-α6和p63双阳性的细胞群体纯度高达95.59%（图4D）。上述数据共同验证了本研究中EpiSCs的成功分离与高纯度。

图4 大鼠皮肤来源的表皮干细胞（EpiSCs）鉴定。（A）提取后第3天，（B）第7天EpiSCs生长情况的光学显微镜图像。（C）EpiSCs特征性阳性标志物（Integrin-α6、CK19、CK15、CD71）和阴性标志物（CD31、CD34）的共聚焦荧光显微图像。（D）EpiSCs中p63和Integrin-α6的流式细胞术检测结果。

3.3 PLLA促进表皮干细胞（EpiSCs）的增殖

为探究PLLA对EpiSCs的影响，我们首先评估了不同浓度的PLLA（0、50、100、250、500、750、1000和2000 μg/mL）对细胞活力的作用。如图5A所示，EpiSCs分别在不同浓度的PLLA微球中培养24和48小时后，细胞生长情况良好。CCK8检测结果显示，仅在处理24小时后，500 μg/mL的PLLA对细胞活力产生了显著影响（图5B）。在处理48小时后，250 μg/mL 和 500 μg/mL浓度下的细胞活力分别达到116.7%和126.3%，相比对照组（0 μg/mL）为100%（图5C）。

此外，研究人员对细胞进行了活/死染色实验，使用Calcein-AM（绿色荧光，表示存活）和PI（红色荧光，表示死亡）进行标记。观察发现，在PLLA浓度为 0、250、500和2000 μg/mL时，几乎未见红色荧光，表明这些处理未引起明显的细胞死亡（图5D）。随后，采用流式细胞术分析细胞凋亡情况，结果显示各组之间的凋亡率相近（图5E）：0 μg/mL为3.10%，250 μg/mL为3.37%，500 μg/mL为3.12%，2000 μg/mL为2.77%。这些组之间未观察到显著性差异（图5F）。综上所述，我们发现PLLA具有促进细胞增殖的潜力，并最终确定500 μg/mL为后续实验的最适浓度。

图5 PLLA微球对EpiSCs活力和凋亡的影响。（A）EpiSCs处理0–2000 μg/mL PLLA微球24小时和48小时后的显微图像。（B）和（C）通过CCK8法检测EpiSCs在不同浓度PLLA微球作用下分别于24小时和48小时后的细胞活力。（D）不同处理组表皮干细胞的荧光图像（绿色表示存活，红色表示死亡）。（E）不同浓度PLLA微球处理后EpiSCs的流式细胞术图像和（F）凋亡统计结果。数据以平均值±标准差（mean ± SD）表示。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001；ns表示无显著性差异。

3.4 PLLA减缓表皮干细胞（EpiSCs）的衰老

PLLA微球对皮肤具有抗衰老作用的相关研究已有报道。本研究旨在探讨PLLA微球是否对大鼠表皮干细胞（EpiSCs）的衰老具有影响。通常情况下，EpiSCs在体外可维持良好的干性至第3代，但到第6代时会出现衰老迹象，并终末分化为角质形成细胞。因此，本实验选用第6代EpiSCs进行研究。干细胞具有较强的增殖能力，因此我们通过Transwell和划痕愈合实验评估EpiSCs的增殖与迁移能力。为模拟PLLA真皮内注射对表皮层的体内作用，我们建立了由表皮干细胞和成纤维细胞组成的体外共培养系统（图1A、C）。

实验结果表明，PLLA可增强EpiSCs的迁移能力，且在成纤维细胞+ PLLA组中效果更加显著（图1B、E）。而仅与成纤维细胞共培养的组与对照组相比未见差异（图1B、E）。此外，在划痕愈合实验中，PLLA可促进EpiSCs的增殖和迁移（图1D、F），而成纤维细胞的存在进一步增强了PLLA所诱导的增殖能力（图1D、F）。同时，β-半乳糖苷酶（β-GAL，衰老标志物）染色结果显示，第6代EpiSCs呈现出更深的蓝绿色，而加入PLLA后可延缓细胞衰老（图1G）。在图1H中，PLLA处理也降低了细胞衰老标志基因p16和p21的mRNA 表达水平。综上所述，PLLA可促进EpiSCs的增殖并在成纤维细胞的参与下延缓其衰老表型。

3.5 PLLA降低EpiSCs的分化程度

如图6A所示，体外培养至第六代的EpiSCs显示出角蛋白10（keratin 10）的高表达，提示细胞在有丝分裂后已终末分化为角质形成细胞。然而，在PLLA+成纤维细胞组中，角蛋白10的表达显著较低（图6D）。Integrin-α6是表皮干细胞附着于基底膜的关键蛋白，同时也是其干性的重要标志物。我们观察到，与PLLA处理组相比，未处理的细胞Integrin-α6表达水平显著降低（图6B、E），说明PLLA有助于抑制细胞分化并维持干性。最新研究发现，COL17A1在维持表皮干细胞活性和抗衰老方面起着重要作用（15, 37）。与对照组相比，PLLA可维持EpiSCs中COL17A1的低水平表达，这一蛋白是基底膜附着的标志物（图6C、F）。CK19的高表达通常与细胞周期延长和未分化状态相关。如图6C和6G所示，第六代EpiSCs中CK19表达水平下降，而在PLLA+成纤维细胞组中，其表达显著升高。

图6 PLLA 微球对EpiSCs分化过程的影响。不同处理条件下（A）Keratin 10、（B） Integrin-α6、（C） COL17A1 和CK19的代表性荧光图像。（D-G）荧光强度的定量分析结果。数据以均值±标准差（mean ± SD）表示。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01；ns表示无显著性差异。

3.6. PLLA在大鼠皮肤中的中胚层注射

为验证PLLA微球对表皮的体内作用，建立了SD大鼠的中胚层注射模型。在大鼠背部左侧进行PLLA微球（340 mg/5 mL）的皮内注射，右侧则注射等体积的生理盐水（图2A，B）。每个区域注射4个点，每个点注射剂量为0.1 mL。

如图2C所示，常规注射深度为皮下层，而中胚层疗法的注射部位为真皮内，距离表皮更近，从而更便于观察PLLA对EpiSCs的作用。因此，本研究中动物实验的PLLA组采用中胚层注射，以评估其对表皮的影响。

3.7. PLLA在体内影响大鼠EpiSCs的分化

在PLLA注射后的第2、4和12周，采集大鼠皮肤样本，进行H&E染色的组织学检查。可以看到，第2周时PLLA微球的直径较大，而第12周时微球的直径随时间推移而减小，提示PLLA在体内发生了降解（图7A）。此外，在微球周围可见致密的组织结构和细胞聚集（图7A）。在第2、4和12周从大鼠皮肤中提取EpiSCs，并进行q-PCR检测。结果显示，第2周和第4周两组之间p16 mRNA水平无显著差异（图7B）；而在第12周，PLLA注射组的p16 mRNA水平低于对照组，提示PLLA可能延缓了大鼠EpiSCs的衰老进程（图7B）。在第4周和第12周，PLLA组的integrin-α6 mRNA水平均高于对照组（图7C）。免疫组化染色结果显示，在前4周内CK19的表达无显著差异；然而在第12周，PLLA组表皮基底层中出现了一群明显的CK19阳性细胞，提示PLLA可能诱导了EpiSCs的分化（图7D）。

图7 PLLA微球对大鼠体内表皮的影响。（A）注射PLLA微球后第2、4和12周大鼠皮肤的苏木精-伊红（H&E）染色图像。（B）不同处理组中p16的q-PCR结果。（C）不同处理组中integrin-α6的q-PCR结果。（D）对照组与PLLA组CK19的免疫组化染色图像。数据以均值±标准差（mean ± SD）表示。*表示p < 0.05；ns表示无显著差异。

4. 讨论

皮肤老化，尤其是面部老化，是身体、面部和颈部软硬组织发生共同变化的结果（1）。其主要表现包括：面部皮肤变薄、弹性下降、水分减少、皱纹出现、光泽与色素沉着减退；皮下脂肪组织减少并局部堆积（38, 39）。近年来，皮肤抗衰老与面部年轻化逐渐受到关注（6, 40, 41）。本研究中，我们评估了PLLA微球真皮内注射对大鼠皮肤的抗衰老效果，并初步探讨了其可能的作用机制。

面部年轻化包括多种治疗方式和方法，旨在恢复衰老面部的年轻外观，涵盖了手术和非手术干预。由于非手术方法具有微创的优势，近年来逐渐受到青睐，例如肉毒素注射、软组织填充剂、激光或射频治疗、自体脂肪移植以及化学换肤等（42–45）。PLLA因其持久性而成为较优选择，相较其他填充剂，它所需补打频率更低，且持续时间可达两年或更久（22，43）。PLLA真皮填充剂是一种可注射的可生物降解材料，可用于恢复皮肤体积、平滑皱纹和增强面部饱满度（21）。与透明质酸填充剂的即时效果不同，PLLA的效果是逐渐显现的（46）。然而，不同PLLA产品在形态上存在一定差异，如可制成片状或微球状（47）。由于早期粒径不均（20–100 μm）易诱发炎症反应，美国食品药品监督管理局（FDA）严格规定PLLA颗粒的直径应控制在25–40 μm之间（24）。PLLA微球具有高度的可塑性、功能性和可控性。将PLLA微球皮下注射至兔背部皮肤，可持续诱导I型和III型胶原蛋白的再生长达13个月，这与异物反应密切相关（31）。在作用机制方面，免疫细胞，尤其是巨噬细胞，可能在PLLA的抗衰老效应中发挥关键作用（48，49）。PLLA可通过上调IL-4、IL-13和TGF-β的表达，诱导巨噬细胞M2型极化并促进胶原蛋白的生成，从而在老化皮肤中发挥作用（23）。

皮肤由两层结构组成，即表皮层和真皮层，这两层之间通过一种精细的细胞外基质蛋白——基底膜相互连接（50）。表皮细胞不断更新，新生细胞来源于表皮层更深处的表皮干细胞及其他祖细胞（9）。在正常情况下，表皮干细胞通过复制和分化产生新细胞，以替代受损细胞，从而维持皮肤的年轻状态（51）。然而，随着年龄的增长，这些干细胞数量逐渐减少，导致皮肤再生能力下降，并引发皮肤老化（52）。胶原蛋白XVII（COL17A1）是一种锚定于基底膜的重要蛋白，位于皮肤基底膜的特定区域，参与维持表皮干细胞活性，对整体皮肤健康具有重要意义（14）。COL17A1的缺失会导致角质形成细胞更新能力降低，表皮层变薄——这两者都是皮肤因老化而出现的典型形态学变化（15）。我们的研究结果也表明，在第六代表皮干细胞中，PLLA能够维持COL17A1的表达水平，相较于对照组更为明显（37）。

由于表皮层具有保护作用，许多治疗手段难以有效作用于真皮层，因此中胚层疗法（即皮内注射）可以有效解决这一问题（53，54）。目前，中胚层疗法已被应用于雄激素性脱发的治疗中（55）。以透明质酸为基础的填充剂进行中胚层注射也被认为是一种有效的皮肤年轻化方法（56）。然而，PLLA的中胚层注射实践仍较为有限，其对表皮的影响尚未被深入研究。本研究中，我们将PLLA微球皮内注射于大鼠背部皮肤，观察到微球逐渐降解，并在体内至少持续存在12周。第12周时，PLLA组的衰老指标优于对照组，提示PLLA微球具有显著的抗衰老作用。

在体外实验中，PLLA 微球多被用作载药工具，且PLLA与其他分子材料的结合能够显著促进成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的产生（57，58）。然而，目前关于PLLA单独作用于体外成纤维细胞的研究仍然有限。有研究报道，PLLA可直接刺激真皮成纤维细胞，通过激活p38、Akt和JNK信号通路增加I型胶原的合成（59）。由于PLLA被注射到真皮而非表皮，与表皮干细胞的基底膜存在空间分离，因此成纤维细胞可能通过分泌外泌体与表皮干细胞建立联系（60）。为此，我们建立了表皮干细胞与成纤维细胞的体外共培养体系。确实，在该共培养系统中，PLLA表现出更明显的抗衰老和延缓分化作用，说明成纤维细胞在PLLA与表皮干细胞之间的“对话”中发挥了重要作用。值得注意的是，这种成纤维细胞与表皮干细胞之间的相互作用也可能是双向的，而PLLA在其中起到了介导作用。这一动态机制仍需进一步研究以深入探讨。

5. 结论

总之，本研究首次探讨了PLLA微球对表皮细胞生物学功能的影响，尤其聚焦于细胞衰老水平。在体外实验中，500 μg/mL 浓度的PLLA微球显著促进了大鼠初代表皮干细胞（EpiSCs）的增殖与迁移，同时延缓了其衰老与分化过程，从而维持了细胞的干性。类似地，在体内进行的中胚层注射实验也获得了一致结果。上述研究结果为PLLA在皮肤抗衰老和年轻化方面的作用机制提供了新的见解。

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