通过微聚焦超声（MFU）增强聚左旋乳酸（PLLA）注射疗效：联合治疗效果及最佳治疗顺序的评估

通过微聚焦超声（MFU）增强聚左旋乳酸（PLLA）注射疗效：联合治疗效果及最佳治疗顺序的评估

金长鑫1，李丹2, 3，詹威2，王世旭2, 4，李高旭2, 4，李瑞雪2, 4，王一杰2, 4，

周博2,4，陈富林4，吴琼2,4

¹空军医科大学西京医院整形重建外科，西安，中国

²西北大学第一附属医院西安市第一医院，西安，中国

³柳大烈医疗集团，广州，中国

⁴陕西省生物技术重点实验室、中国西部地区资源生物学与现代生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院，西安，中国

通讯作者: 陈富林 (chenfl@nwu.edu.cn) ，吴琼 (wuqiong@med.nwu.edu.cn)

关键词：联合治疗，微聚焦超声，聚乳酸，皮肤再生，III型胶原蛋白

摘要

引言:
聚左旋乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）与微聚焦超声（micro-focused ultrasound，MFU）均被广泛应用于皮肤年轻化治疗，两者通过不同的作用机制促进胶原重塑。尽管在临床实践中联合应用较为常见，但其最佳治疗顺序及安全性特征仍缺乏明确证据。本研究旨在通过临床前模型评估PLLA与MFU联合治疗的协同效应及理想治疗顺序，为临床方案制定提供依据。

方法:
选用3只巴马小型猪，在腹部皮肤划分的不同区域实施6种处理条件：（a）单纯PLLA；（b）单纯MFU；（c）MFU后即刻进行PLLA注射；（d）MFU后1个月进行PLLA注射；（e）PLLA注射后1个月进行MFU治疗；（f）未处理对照。采用Löviselle PLLA进行皮下注射，MFU治疗使用MFUS Pro系统。于第180天采集皮肤活检标本。通过组织学染色（Masson三色染色、Sirius Red染色、Verhoeff–Van Gieson染色、HE染色）、扫描电镜（SEM）及定量图像分析，评估真皮厚度、胶原亚型分布、弹力纤维再生、脂肪隔结构以及PLLA微球稳定性。

结果:
与对照相比，单纯PLLA使真皮厚度增加23.7%，Ⅲ型/Ⅰ型胶原比例升至0.79 ± 0.06（p < 0.01）。单纯MFU主要促进Ⅰ型胶原生成（Ⅲ/Ⅰ比例为0.39 ± 0.04），并改善胶原纤维排列。MFU即刻联合PLLA的治疗方案效果最佳：真皮厚度增加35.2%，Ⅲ/Ⅰ型胶原比例达到0.92 ± 0.05（均p < 0.01）。该组同时表现出更致密的弹力纤维、更规整的脂肪隔结构，以及在SEM下最为紧密的胶原形态。MFU并未加速PLLA降解或增加炎症反应，与单纯PLLA组相比，微球粒径及炎性细胞浸润均无显著差异（p > 0.05）。

结论:
在PLLA注射前即刻应用MFU，可较单一治疗方式更有效地增强真皮结构重塑，且不会影响PLLA微球的稳定性。本研究结果支持该联合治疗策略在临床中的潜在价值和安全性，并为皮肤年轻化治疗方案的优化提供了循证依据。

引言

皮肤松弛是衰老过程中常见的临床表现，其特征包括真皮弹性下降、胶原生成减少以及真皮厚度变薄。有效的治疗策略通常以刺激胶原合成为核心目标，从而恢复皮肤的紧致度与弹性。在众多治疗手段中，作为一种医疗器械，聚左旋乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）已被证实可通过逐渐且持续地诱导胶原新生，在改善皮肤松弛方面具有确切疗效[1]。PLLA良好的生物相容性及其诱导皮肤结构性改善的能力，使其成为美学治疗中广泛应用的选择[2]。

微聚焦超声（micro-focused ultrasound，MFU）是一种传统的无创紧肤治疗方式，通过将超声能量精准作用于真皮及皮下组织，形成热凝固点。这种热效应可刺激胶原重塑和弹力纤维生成，从而改善皮肤的紧致度与弹性。由于其能够精准作用于特定皮肤层次，包括浅表肌腱膜系统（superficial muscular aponeurotic system，SMAS），MFU已成为治疗皮肤松弛的常用技术之一[3]。

尽管PLLA和MFU作为单独治疗手段均具有良好疗效，但在临床实践中，两者的联合应用正日益增多，以期获得更优的治疗效果。PLLA通过胶原新生提供逐步且持久的结构支撑，而MFU则可带来即时的紧致效果并促进弹力纤维生成。既往研究已在能量源设备与注射治疗联合应用中观察到类似的协同效应[4]。例如，有研究显示，将MFU-V与高稀释CaHA-CMC注射联合应用可显著改善皮肤松弛，其中先行MFU-V、后行CaHA-CMC的治疗顺序在弹力纤维生成及患者满意度方面表现更佳[5]。另一项关于在填充剂上方实施单极射频（RF）治疗的研究发现，与PLLA、CaHA等注射填充剂联合使用时，可增强成纤维细胞增生和胶原沉积[6]。此外，有研究证实，点阵CO₂激光联合透明质酸注射可显著改善皮肤质地和水合状态，且点阵CO₂激光有助于促进透明质酸的扩散并刺激胶原生成[7]。进一步的研究还表明，Nd:YAG调Q激光联合光声脉冲技术及鲑鱼来源多核苷酸（polynucleotide，PN）注射，可显著改善皮肤亮度、色素沉着及弹性，显示出其在面部光老化年轻化中的潜在价值[8]。

尽管多种联合治疗策略已报道取得积极疗效，但在临床实践中仍存在顾虑，即能量源设备可能对可降解的胶原刺激材料造成结构性干扰，从而影响其治疗效果[9]。因此，明确主流胶原刺激材料（如PLLA）与传统能量治疗手段（如MFU）联合应用的安全性、有效性及最佳治疗顺序具有重要的临床意义。解决上述问题将有助于优化临床治疗流程，确保疗效的稳定性与可重复性。

基于此，本研究通过在临床前动物模型中系统分析不同治疗顺序的效果，旨在为PLLA与MFU联合应用提供基础性循证依据。研究结果有望为未来临床方案的制定提供指导，从而优化皮肤松弛与弹性改善的治疗结局。

材料与方法

实验动物与研究设计

本研究选用3只去势雄性巴马小型猪作为实验动物，年龄为6–8个月，体重约45 kg。巴马小型猪皮肤在真皮厚度、成纤维细胞密度、胶原组成及弹力纤维分布等方面与人类皮肤高度相似，因此被广泛认为是皮肤研究的理想动物模型。本研究将上述3只小型猪作为平行实验个体，以保证实验结果的可重复性和可靠性。所有动物均饲养于标准实验动物房条件下，环境温度维持在18–24 °C，采用12 h明暗交替的光照周期[10]。实验期间为动物提供充足的食物和饮水，并将体重增长控制在5%以内。每月监测一次体温以确认动物的健康状况。

所有实验方案均经西北大学生命科学学院实验动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC）审查并批准（批准编号：IACUC-20241487），所有实验操作均符合国家及机构关于实验动物伦理使用的相关规范。

将每只猪的双侧腹部皮肤划分为6个区域，每个区域大小为5 cm × 5 cm，并通过计算机生成的随机数字序列将各区域随机分配至以下6个处理组（图1）：（a）单纯PLLA注射；（b）单纯MFU治疗；（c）MFU治疗后即刻进行PLLA注射；（d）MFU治疗后1个月进行PLLA注射；（e）PLLA注射后1个月进行MFU治疗；（f）不进行任何处理。治疗前，所有动物均采用戊巴比妥进行全身麻醉。

在PLLA治疗中，每瓶含170 mg的Loviselle聚左旋乳酸（长春圣博玛生物材料有限公司，采用专有的PLLA-LaSynPro™技术合成）。以2 mL生理盐水复溶后，使用钝针以平铺方式进行皮下注射。MFU治疗采用微聚焦超声设备MFUS Pro（生产厂家：湖南半岛医疗科技有限公司），配备MFUS-D 3.0探头。按照厂家操作规范，设备以滑动模式对每个治疗区域作用3 min，治疗前于皮肤表面均匀涂抹导电凝胶。

于治疗后第0、30、60、90、120、150及180天测量动物体重和体温。于第180天，采用5 mm皮肤活检冲针，从各处理区域采集包含表皮、真皮及皮下组织在内的皮肤组织样本，用于后续分析[11]。

图. 1  本研究所采用的实验设计示意图。将每只猪的双侧腹部皮肤划分为6个区域，每个区域大小为5 cm × 5 cm，并随机分配至以下6个处理组之一：（a）单纯PLLA注射；（b）单纯MFU治疗；（c）MFU治疗后即刻进行PLLA注射；（d）MFU治疗后1个月进行PLLA注射；（e）PLLA注射后1个月进行MFU治疗；（f）不进行任何处理。

组织学方法

采集的皮肤组织样本在室温下置于4%多聚甲醛中固定48 h，随后经梯度乙醇（70%–99%）脱水，并通过二甲苯系列进行透明处理。之后将样本石蜡包埋，并使用切片机切制为厚度为3–5 μm的连续切片[12]。在真皮厚度测量中，于4×放大倍率下在每张切片上按固定间隔随机选取3条垂直测量线，沿每条线测量基底层至脂肪层之间的距离。每个处理组的平均真皮厚度通过对同组3只巴马小型猪的测量结果取平均值获得[13]。随后以未处理对照组为基线，计算各治疗组真皮厚度的变化比例。

胶原定量分析采用ImageJ软件（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）进行[14]。在HSB（色相-饱和度-亮度）色彩空间内，利用半自动分割方法对胶原进行识别与分析。胶原密度以20×放大倍率下切片中胶原阳性像素所占面积比例表示，取值范围为0%–100%[15]。所有组织学切片均进行编码，并在盲法条件下完成分析，以尽量减少观察者偏倚并确保方法学严谨性。

组织学染色分析

采用Masson三色染色评估胶原纤维再生情况，其中胶原纤维呈蓝色、肌纤维呈红色、细胞核呈黑色，可用于对结缔组织修复进行直观评估。偏振光下的Sirius Red染色用于定量分析Ⅰ型胶原（红色）和Ⅲ型胶原（绿色），并通过ImageJ软件计算Ⅲ型/Ⅰ型胶原的比例。采用Verhoeff–Van Gieson染色对弹力纤维进行定性分析，以评估治疗组织中弹力纤维的密度及结构完整性。HE染色用于评估MFU治疗是否加速了皮下注射PLLA微球的降解。不同粒径范围内微球分布的定量结果取3只巴马小型猪的平均值。

扫描电镜分析

用于扫描电镜（SEM）观察的皮肤样本先在4 °C条件下以2.5%戊二醛固定24 h，随后经梯度乙醇（50%–100%）脱水，并喷镀一层薄金以增强导电性。SEM成像采用Helios系统，在加速电压5 kV、放大倍率250×条件下进行[16]。分析重点包括不同处理组中胶原纤维的形态、表面纹理及结构变化，从超微结构层面揭示各治疗方式对组织的影响。

统计学分析

所有数据均以均值 ± 标准差（mean ± SD）表示。统计分析采用GraphPad Prism 9.0软件（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣迭戈）完成[17]。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用t检验。统计学显著性水平设定为p < 0.05，以“*”表示；高度显著性差异设定为p < 0.01，以“**”表示。

结果

研究对象的生理指标监测

在整个研究过程中，各时间点动物的体温均保持稳定，范围为38.2 °C–38.5 °C，提示巴马小型猪始终处于良好的生理健康状态。体重随时间呈稳步增长趋势，截至第180天，相较基线体重的增幅均低于10%（表1）。上述适度的体重增长表明，动物体重变化处于正常生长范围内，不太可能对本研究结果产生显著影响。

表 1  研究期间巴马小型猪体重及体温变化情况

真皮厚度变化

组织学分析显示，与未处理对照组（f组）相比，所有治疗组的真皮厚度均显著增加。单纯PLLA注射（a组）可引起中等程度的真皮增厚，而单纯MFU治疗（b组）的增厚效果相对较弱。值得注意的是，所有包含PLLA的治疗组（a、c、d 和 e组）其真皮增厚程度均显著高于仅接受MFU治疗的b组（p < 0.01）。在联合治疗组中，c组（MFU治疗后即刻进行PLLA注射）表现出最为显著的真皮厚度增加（p < 0.05）（图2）。上述结果表明，PLLA注射在真皮增厚中起主导作用，而与MFU序贯联合应用可进一步放大这一效应。

图. 2  各实验组在治疗后180天相对于未处理区域的真皮厚度平均变化率。A组：单纯PLLA注射；B组：单纯MFU治疗；C组：MFU治疗后即刻进行PLLA注射；D组：MFU治疗后1个月进行PLLA注射；E组：PLLA注射后1个月进行MFU治疗。误差线表示测量结果的标准差（SD）。统计学显著性以 * 表示 p < 0.05，以 ** 表示 p < 0.01。

胶原纤维再生与重塑

与未处理对照组（f组）相比，单纯MFU治疗（b组）主要表现为对胶原纤维结构的优化（图3A），但其促进新生胶原生成的作用相对有限。相较之下，所有包含PLLA的治疗组（a、c、d 和 e组）均显著提高了胶原密度，提示PLLA能够有效刺激新生胶原合成（p < 0.05）（图3B）。在偏振光下进行的Sirius Red染色结果显示，MFU治疗（b组）主要增加Ⅰ型胶原，而PLLA治疗（a组）则显著上调了通常更为细致、纤细的Ⅲ型胶原（图3C）。在联合治疗组中，尤其是c组（MFU治疗后即刻进行PLLA注射），Ⅲ型/Ⅰ型胶原比例显著高于d组、e组及各单一治疗组（p < 0.01）（图3D）。扫描电镜（SEM）进一步直观展示了不同处理条件下胶原纤维的结构与形态特征。未处理对照组（f组）中，胶原纤维稀疏且排列紊乱；PLLA治疗组（a组）由于新生Ⅲ型胶原的显著增加，胶原密度明显提高，呈现出“纤维更细密”的整体形态特征。值得注意的是，c组（MFU即刻联合PLLA）表现出最为均一、致密且排列有序的胶原纤维结构，体现了PLLA诱导胶原增生与MFU改善纤维排列两种效应的叠加与协同。因此，该联合治疗方案在胶原重塑方面展现出最优效果（图3E）。

图 3  治疗后180天皮肤胶原再生与重塑情况。（A）Masson三色染色显示各实验组胶原分布及结构组织特征；（B）各组胶原密度的定量分析，反映不同治疗方式诱导的变化；（C）偏振光下的Sirius Red染色，用于区分Ⅰ型胶原（红色）与Ⅲ型胶原（绿色）；（D）Ⅲ型/Ⅰ型胶原比例的定量分析结果；（E）250×放大倍率下的扫描电镜（SEM）图像，展示胶原纤维的形态及排列情况。各处理组包括：（a）单纯PLLA注射；（b）单纯MFU治疗；（c）MFU治疗后即刻进行PLLA注射；（d）MFU治疗后1个月进行PLLA注射；（e）PLLA注射后1个月进行MFU治疗；（f）不进行任何处理。定量分析结果以标准差（SD）表示误差线，统计学显著性以 * 表示 p < 0.05，以 ** 表示 p < 0.01。所有图像均在一致的200 μm视野宽度下获取，以确保直接可比性。

皮下脂肪间隔结构变化

采用Masson三色染色评估不同治疗方式对皮下脂肪层的影响，重点观察纤维性脂肪隔的变化。未处理对照组中，脂肪隔表现为薄而稀疏，排列紊乱，胶原含量较少。PLLA治疗可显著增加脂肪隔厚度并促进胶原沉积，而MFU治疗则主要改善既有纤维性脂肪隔的排列和组织结构。在联合治疗中，尤其是MFU即刻联合PLLA组，脂肪隔增厚最为明显，结构致密且排列规整，提示两种治疗方式之间存在明显的协同作用（图4）。上述结果与真皮层观察到的改善趋势一致，进一步表明PLLA与MFU在多个组织层次上发挥互补效应。

图 4  治疗后180天不同实验组皮下脂肪组织及结缔组织的Masson三色染色代表性图像。（a）单纯PLLA注射；（b）单纯MFU治疗；（c）MFU治疗后即刻进行PLLA注射；（d）MFU治疗后1个月进行PLLA注射；（e）PLLA注射后1个月进行MFU治疗；（f）不进行任何处理。蓝色染色代表胶原纤维，白色空隙表示脂肪组织空泡。所有图像均在500 μm视野宽度下采集。

对弹力纤维合成的影响

Verhoeff–Van Gieson染色结果显示，六个处理组之间在弹力纤维再生方面存在明显差异。未处理对照组（图5f）弹力纤维密度最低，纤维分布稀疏且形态不规则。与未处理组相比，单纯PLLA注射组（图5a）表现出更好的弹力纤维再生，染色强度和纤维密度均有所增加。而单纯MFU治疗组（图5b）的改善幅度略低于PLLA单独治疗组。三种联合治疗组在弹力纤维再生方面均优于单一治疗组。其中，c组（MFU治疗后即刻进行PLLA注射）和d组（MFU治疗后1个月进行PLLA注射）改善最为显著，表现为弹力纤维致密、排列有序且染色加深（图5c、图5d）。上述结果表明，PLLA注射联合MFU治疗在促进弹力纤维再生方面较单一治疗方式更为有效。

图 5  六个处理组弹力纤维的Verhoeff–Van Gieson染色结果。经Verhoeff–Van Gieson染色的组织切片显示，不同处理组之间弹力纤维再生情况存在差异：（a）单纯PLLA注射；（b）单纯MFU治疗；（c）MFU治疗后即刻进行PLLA注射；（d）MFU治疗后1个月进行PLLA注射；（e）PLLA注射后1个月进行MFU治疗；（f）不进行任何处理。

MFU对PLLA稳定性及炎症反应的影响

采用HE染色评估治疗后皮下脂肪层中PLLA微球的稳定性。在a组（单纯PLLA注射组）中，可见微球结构完整、分布均匀，周围伴有轻度炎性细胞浸润，提示典型的生物刺激反应。在d组（PLLA注射后1个月进行MFU治疗）中，PLLA微球同样保持良好的结构完整性，未见加速降解或碎裂的证据。此外，MFU治疗并未加重PLLA植入所诱导的炎症反应，微球周围炎性细胞浸润程度与单纯PLLA组相当（图6A）。进一步的定量分析显示，两组（a组与d组）中PLLA微球的粒径分布相似，在各测量粒径范围内均未观察到显著差异。这表明，在观察期内，MFU治疗不会改变PLLA微球的降解模式或粒径分布特征（图6B）。上述结果证明，MFU与PLLA联合应用在皮下组织重塑中具有良好的相容性与安全性。

图 6  PLLA注射后180天，a组（单纯PLLA注射）与d组（PLLA注射后1个月进行MFU治疗）中PLLA微球的组织学比较及粒径分布情况。（A）a组（上）与d组（下）的HE染色代表性组织学图像，显示PLLA注射后180天组织内可见PLLA微球（白色透明的球形结构）。比例尺 = 100 μm；（B）a组（蓝色柱）与d组（橙色柱）中不同粒径范围PLLA微球的分布情况，误差线表示标准差。

讨论

聚左旋乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）是一种在医学美容领域被广泛应用的器械材料，以其独特的作用机制和持久的疗效而著称[18]。不同于主要提供即刻保湿和体积支撑作用的透明质酸（hyaluronic acid，HA），PLLA作为一种生物刺激材料，可在真皮层内逐步促进胶原合成，从而在数月内实现持续的结构性改善并增强皮肤弹性[19]。围绕PLLA的研究已较为充分，其在身体多个部位均获得了成功应用。既往研究证实，PLLA在面部年轻化、改善下面部及颈部皮肤松弛、以及中面部容量丢失方面具有确切疗效[20,21]。此外，在非面部适应证中，如手部、颈胸部（décolletage）及臀部外观改善方面，PLLA同样展现出良好的应用前景[22,23]。PLLA的多功能性及良好的生物相容性，使其成为医学美容治疗体系中的重要组成部分，可满足不同患者和多种解剖部位的治疗需求[24]。

以微聚焦超声（micro-focused ultrasound，MFU）为代表的能量源设备，可通过诱导热效应刺激胶原重塑和弹力纤维生成，从而与注射类治疗形成互补[25]。MFU尤其擅长通过热诱导成纤维细胞活化，在浅表肌腱膜系统（SMAS）及网状真皮等深层组织中促进Ⅰ型胶原生成并增加真皮厚度[13]。当MFU与PLLA联合应用时，后者在早期阶段主要刺激Ⅲ型胶原生成，并在随后的时间过程中维持Ⅰ型胶原沉积，两种治疗方式可产生协同效应[26]。MFU通过热凝固点对真皮进行“预处理”，从而增强PLLA的生物刺激效应，实现长期的组织重塑。这种分层、序贯的治疗策略可同时兼顾即刻的皮肤紧致效果与持久的结构性改善[27]。

本研究结果表明，将PLLA与MFU相结合，可在组织重塑方面取得显著优于单一治疗方式的效果。其中，MFU在PLLA注射前即刻应用的序贯方案，在真皮结构改善方面表现最为突出，具体体现在胶原与弹力纤维再生增强以及皮下脂肪隔结构更加规整。更为重要的是，MFU治疗后PLLA微球仍保持良好的结构稳定性，未观察到降解加速或炎症反应增强的现象，从而证实了两种治疗方式联合应用的安全性与相容性。

尽管既往曾假设过量的热能可能对PLLA微球结构产生干扰[28]，但本研究结果显示，无论MFU应用时序如何，在注射后6个月内均未发现PLLA微球存在结构不稳定或降解加速的情况。此外，MFU处理组与单纯PLLA组在炎性细胞浸润程度方面并无显著差异，提示PLLA微球在热效应下的稳定性可能与其微观分子结构及平均链长密切相关。这一发现强调了在临床实践中优化MFU治疗参数、平衡安全性与疗效的重要性。

为提高临床前研究的相关性，本研究选用了巴马小型猪作为动物模型，其在胶原组成、真皮厚度及皮肤附属器结构等方面与人类皮肤具有较高相似性[13]。然而，我们亦需认识到，不同物种之间在代谢速率、免疫反应强度及创伤修复动力学方面仍存在差异，这些因素可能影响组织重塑反应的幅度与持续时间。因此，本研究所报告的定量组织学结果更应被视为机制层面的证据，而非对人类临床疗效的直接预测。尽管如此，各治疗组之间观察到的一致性组织学变化模式，仍支持该联合治疗策略具有良好的转化潜力。未来仍需在不同肤质及不同人群中开展人体研究，以在真实临床条件下验证上述发现，并进一步阐明PLLA与MFU相互作用的分子机制，尤其是热诱导成纤维细胞活化在其中所发挥的作用。

结论

本研究证实，PLLA与MFU联合应用可产生显著的协同增效作用，其中以MFU先行、随后即刻进行PLLA注射的治疗顺序在真皮厚度增加、胶原密度提升及弹力纤维再生方面表现最为突出。更为重要的是，MFU并未加速PLLA微球的降解过程，提示两者在联合应用中的安全性与良好相容性。上述结果为进一步优化临床治疗流程提供了科学依据，未来仍需开展更多研究，以推动该联合治疗策略在更广泛临床场景中的应用与规范化。

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